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蛋白电泳与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与应用

发布时间:2022-11-27 10:33:20 阅读:11572次 来源:百度学术

  蛋白电泳是研究蛋白质性质的一种相对简单、快速和高灵敏度的工具。它是分析化学、生物化学和分子生物学的主要工具。通过电泳分离蛋白质是基于这样一个事实,即带电分子将在施加电场时通过基质迁移。蛋白质电泳分离的基质是聚丙烯酰胺。 用于形成聚丙烯酰胺的化学试剂是单体丙烯酰胺和N,N'-双丙烯酰胺(双-丙烯酰胺)。聚合丙烯酰胺和双丙烯酰的方法是使用 TEMED(四*基乙二胺)和过硫酸铵。聚丙烯酰胺凝胶内部的聚合形成了一个交联的微孔网络。这种孔隙网络允许小蛋白质分子快 速通过,同时减缓较大蛋白质的迁移。这导致基于其分子大小的蛋白质分离。

  聚丙烯酰胺凝胶基质中孔的大小由每单位体积使用的总丙烯酰胺的量和使用的双丙烯酰胺的相对百分比确定。聚丙烯酰胺凝胶的有效范围在3-30%之间。

  SDS PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)存在两种根本不同类型的凝胶系统,非解离(非变性)和解离(变性)。非解离(非变性)系统旨在在保留蛋白质功能和活性的条件下分离天然蛋白质。相比之下,解离系统旨在将蛋白质变性为其成分的多肽,从而检查样品的多肽组成。变性系统可能是最常用的,被称为 SDS-PAGE。

  SDS-PAGE 蛋白质鉴定过程中使用的 SDS 代表十二烷基硫酸钠,一种阴离子去污剂,可使蛋白质变性并将每个多肽链展开成线性方向。SDS 还根据其质量对每种蛋白质施加均匀分布的负电荷。

  在 SDS-PAGE 中,蛋白质混合物通过在 100°C 下在过量 SDS 存在下加热而变性,并使用还原剂(β-巯基乙醇、TCEP、DTT)来破坏二硫键。在这些条件下,所有还原的多肽结合相同量的 SDS(1.4g SDS/g 多肽),与蛋白质的氨基酸组成和序列无关。SDS-蛋白质复合物形成一个杆,其长度与蛋白质的分子量成正比。所有蛋白质现在都带负电荷,电荷密度相似,因此可以仅根据它们的大小进行分离。

  SDS-PAGE 主要用于以下目的:

  1. 蛋白质大小的估计。

  2. 蛋白质亚基或聚集结构的测定。

  3. 蛋白质纯度的估计。

  4. 蛋白质定量。

  5. 监测蛋白质完整性。

  6. 比较不同样品的多肽组成。

  7. 分析多肽亚基的数量和大小。

  8. 蛋白电泳后应用,例如蛋白质印迹。

  实验中的SDS-PAGE使用DIY自行配置的话需要1个小时左右,比较耗时费力,目前很多实验室为了提升实验效率一般选用提前配置好的预制胶,比如天能的Biofuraw Precast Bis-Tris Gel 系列预制胶,在电泳过程中有效避免了Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶所出现的“外八”现象,跑胶效果稳定均一。在节约用户时间的同时,也保证了实验的质量。


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