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如何提高细胞的转染效率

2022-11-18 10:16:26
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  有的同学做了转染,连接目的基因的载体带荧光,转染后48小时在荧光显微镜下观察,却发现只有约百分之15左右的荧光,问该怎么提高转染效率?有没有必要接着往下做筛选?还是重新转染一次?

  1、

  如果要是做稳定筛选的话,15%的转染率应该够了。

  提高转染效率的话,可以适当降低转染时细胞的密度(我试过60~70%的密度比90%更好一些),另外还有可能就是细胞的生长状态,还有在接种后24h内进行转染。

  2、

  转染应该在对数生长期内进行才能保证转染效率,因为该时期细胞生长状态良好,容易吸收外源质粒,而不同细胞株的对数生长期是有差异的,因此建议先绘制培养细胞的生长曲线、确定其对数生长期,然后再着手做转染。

  二、

  有同学用293细胞包装病毒,转染有荧光(约百分之二十),但是感染总是没有荧光,感染细胞状态很好,第四天后开始变圆脱落。转染后的细胞没有抗性,不能筛。

  1、

  20%的转染率太低了,一般用293T包装慢病毒转染率达到80%以上.转染率太低和293T的代数有关系,还和质粒的浓度和纯度有关系。

  2、

  转染的前一天将细胞传代,根据你的细胞生长速度,传成适当的密度,保证第二天细胞达到70%左右,做转染。有的人用脂质体转染,由于脂质体对细胞有毒性作用,细胞特别容易脱落,所以防止细胞脱落,是提高转染效率的关键。

  3、

  转染的效率根本上还是由细胞种类决定的,有些细胞系好转,效率高,有些就不怎么好了。但是我们还是可以尽可能的提高转染效率,之前提过,细胞生长状态要好,这个很重要。另外,每种细胞系都有自己的最好用的转染试剂,要多看文献知道这种细胞系用哪种转染试剂最多。然后自己可以按照DNA和转染试剂的比例做个曲线,看看reporter的表达效率,做到好的转染效率。其实DNA的质量也很重要,不仅仅是内毒素影响细胞的生存,一般情况下DNA超螺旋最好比列越高越好。为了促进表达,转染前线性化也可以。

  如果有些细胞系确实难转,就应该考虑其他方法了,电穿,病毒之类的。amaxa的nucleofector可以直接把质粒打到核里,很好用。

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