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染色质免疫共沉淀值得注意的15个细节总结

2022-11-22 10:28:48
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  染色质免疫共沉淀,又叫 Chip(Chromatin Immunoprecipitation)。Chip 又正好是英语里面薯片的意思。为了有趣,就叫薯片实验吧。做薯片做了几个月,时间不长,但深刻体会到了魔鬼都在细节中和细节决定成败。现在把值得注意的 15 个细节总结如下:

  1、cell counting:尽量做到准确准确再准确,否则会影响 input 结果。

  2、cross link:甲醛的终浓度是 1%,这个基本所有的 protocol 上都会强调。

  3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的 tip 头,在液面下吹打,否则很容易产生气泡,后面的 sonication 就麻烦了。

  4、sonication:Chip 实验中最重要的一部分,合适的条件要自己摸索,可以一次尝试不同次数的 sonication,然后建议采用 EZ-ChIP 上推荐的方法看看 sonication 的效果如何。

  5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or G 之前要先混匀,因为 salmon sperm DNA 是很粘稠的物质,若不混匀,后面你会发现 beads 的量不一样,自然也会影响实验的结果。

  6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净,但最后一个要尽量吸干净,必要时可用 gel loading tips 吸。

  7、含 beads 的 samples 离心时,有的 protocol 上推荐是 1000rpm,45 秒,但可以根据情况调整,但要注意转速不能太快防止 beads 破碎。(当然如果采用的是 magnetic 的 beads 就不存在这个问题)

  8、reverse crosslink 可以是 65°C 4 个小时,也可以 overnight。

  9、reverse crosslink 后的在进行下面步骤之前建议先离心,把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。

  10、每次行 real time PCR 之前都要把 sample 离心保证取样的准确。

  11、1~10ul 的枪取 3ul 以上才比较准确,所以考虑好自己 PCR 反应体系的配置。

  12、一个 Chip 实验一般需要 3~4 天的时间。但是,其中有几个步骤是可以中途停下来的。毕竟,谁也没有办法不眠不休地连续 3、4 天一口气做完。下面是几个可以停下来喘口气的地方:

  (1)细胞收集:用含蛋白酶抑制剂的 PBS 洗涤离心,去上清的细胞收集液可置-80°C 冻存;

  (2)用 SDS 重悬细胞后可置-80°C 冻存;

  (3)sonication 结束,离心后的上清置新的离心管后可-80°C 冻存;

  (4)reverse cross-link 后的标本可-80°C 冻存。冻存后就可以该干啥干啥去了。想接着做的时候,拿出来解冻就可以啦。

  13、agarose beads 的 wash 过程中以及后面的 DNA 提取过程中乙醇的 wash,可以用细胞室的那种吸引器,接上 200ul 的 tip 头吸,这样会节省很多时间(每个实验室情况可能不一样)。

  14、DNA 提取后建议用水溶解 DNA,因为 TE buffer 里的 EDTA 可能会影响 PCR 反应体系中的 Mg2+。

  15、溶解 DNA 的水量可以根据 PCR 反应体系的要求适当调整。

  综上所述,我们探讨了做 Chip 实验需要注意的 15 个小细节。细节虽小,但是却很重要。需知魔鬼都是在细节中!

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