小鼠肝细胞原代培养实验方法原理

　　将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。

　　小鼠肝细胞原代培养实验材料

　　小鼠

　　试剂、试剂盒

　　DMEM无血清DMEM培养基胰酶PBS

　　仪器、耗材 饭盒纱布剪子镊子烧杯平皿研磨玻片滤网离心管6孔培养板吸管移液管手套微量加样器

　　小鼠肝细胞原代培养实验步骤

　　一、实验材料准备

　　1.动物：小鼠。

　　2.试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS。

　　3.器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。

　　4.准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。

　　二、方法

　　1.将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。

　　2.剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。

　　3.用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。

　　4.视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

　　5.加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。

　　6.用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。

　　7.再次离心5 min，弃上清液。

　　8.加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

　　9.加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。

　　注意事项：

　　小鼠肝细胞原代培养在细胞培养过程中，从实验室的设计到实验过程中的操作，都需要严格控制无菌。由于细胞对于生长的条件比较苛刻，所以小鼠肝细胞无论从实验室的设计，还是使用的物品及细胞培养的操作过程，都要注意保持无菌环境。