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原代细胞培养操作步骤(胰酶消化法与组织块直接培养法)

2022-10-22 10:28:04
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  原理:将动物机体的所有组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置适宜的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程之为称原代细胞培养。

  原代细胞培养操作步骤

  (一)胰酶消化法

  1、器材:将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,放入75%酒精泡2—3秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和**浸入体内)然后用碘酒**腹部,取胎鼠带入超净台内(或者将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。

  2、用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。

  3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中。

  4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20—40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。

  5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。

  6、静置5—10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。

  7、1000rpm,离心10分钟,弃上清液。

  8、加入Hank’s液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。

  9、加入培养液l—2 ml(视细胞量),血球计数板计数。

  10、将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25ml细胞培养瓶中,37℃下培养。 上述消化分离的方法是基本的方法,在该方法的基础上,可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同,所采用的消化酶也不相同(如胶原酶,透明质酶等)。

  (二)组织块直接培养法

自上方法第3步后,将组织块转移到培养瓶,贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37℃继续培养


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