细胞划痕实验原理

　　细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，是研究细胞迁移的体外实验中较简单的方法。细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。

　　实验材料：细胞样品

　　仪器、耗材：6孔板 marker笔 直尺 *头 20微升枪头(灭菌)

　　试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS

　　实验步骤：

　　一.准备：

　　所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）

　　二.流程：

　　(1)准备工作：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min(超净台内)

　　(2)先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

　　(3)在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。

　　(4)第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。

　　(5)用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。

　　(6)放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样，拍照。

　　注意的几个问题：

　　1、划痕前是不倒培养基的，划痕后再倒掉培养基加PBS清洗后加吴学谦培养基；

　　细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。因此是整个培养皿都加培养基的，观察部位是划痕而已。

　　2、通过算每个视野的划痕面积，可以通过image J 软件计算。

　　3、划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。）

　　.划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。因为

　　a.这些细胞本身有迁移能力，且较强。

　　b.细胞有极性，方便测量，观察。

　　c.细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。

　　4、其实在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell+matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质，侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说，可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动，是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。