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细胞转染常用到的几种方法

发布时间:2022-09-22 10:32:26 阅读:11812次 来源:武汉华联科生物

  作为一条标准的实验狗,细胞转染这条路可谓是荆棘丛生,很多实验狗们看见细胞转染率低就把细胞给扔掉了!中洪小编告诉你,千万别这样“作死”,因为实验材料也很贵的啊!!科研道路十分漫长,今天我们来看看细胞转染实验大比拼。

  首先我们看看细胞转染有哪些常见方式:

  细胞转染途径

  化学介导——利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷

  DEAE

  磷酸钙法

  人工脂质体法

  物理介导——在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA

  显微注射法

  电穿孔法

  基因枪法

  病毒介导——利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中

  逆转录病毒

  腺病毒

  小编总结了几种经典的传统方法,在此一一做一个介绍。

  磷酸钙共沉淀

  原理:该法可用于瞬时或稳定转染。然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感,所得结果容易出现差异,且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性,转染效率较差。

  实验步骤:将核酸与氯化钙在磷酸盐缓冲液中混合,同时控制好pH、温度等条件 → 室温孵育,生成浓缩DNA的极小不溶性颗粒沉淀 → 将颗粒型沉淀分散到细胞中,促进DNA粘附在细胞表面 → 共沉淀通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或者选择稳定性传染。

  人工脂质体法

  原理:带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。这种方法几乎适用于所有细胞,转染效率高、重复型好,但转染时需要去除血清,转染效果随细胞类型变化大。

  实验步骤:在单独试管中分别稀释核酸及转染试剂 → 脂质体与核酸的磷酸骨架结合,形成复合物 → 脂质体上的正电荷有助于复合物与细胞膜结合 → 复合物通过内吞作用进入胞浆 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。

  病毒转染

  原理:对于用脂质体不能实现转染的细胞,可以采用病毒转染。可用于蛋白质过表达或抑制,是临床研究中最常用的方法。它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中,可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。

  实验步骤:通过基因克隆生成重组病毒 → 采用非病毒法转染包装细胞系,扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞(含有病毒特异性的受体)→去除培养物中的病毒,并加入新鲜培养基→分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。

  电穿孔法

  优点

  缺点

  磷酸钙共沉淀

  1.便宜且容易获得。

  2.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。

  3.转染效率高(不限制细胞系)。

  1.需要仔细制备试剂 – CaPO4溶液对pH,温度和缓冲盐浓度的变化敏感。2.可重复性较差。

  3.有细胞毒性,尤其对原代细胞。

  4.不能采用RPMI培养基,由于其含高浓度的磷酸盐。

  5.不适用于动物体内转染。

  病毒转染法

  1.高转染效率(对原代细胞有80-90%)。

  2.适用于较难转染的细胞系。

  3.可用于体内转染。

  4.可用于构建稳定表达或瞬时表达的细胞系。

  1.被转染的细胞系必须含有病毒受体。

  2.基因插入大小受限(病毒载体~10 kb,非病毒载体~100 kb)。

  3.技术难度高,且构建重组蛋白很费时。

  4.存在生物安全问题(激活潜在疾病,免疫原性反应,细胞毒性,插入突变,使细胞恶性转化)。

  人工脂质体法

  1.操作快速简单。

  2.结果可重复。

  3.转染效率高。

  4.可转染DNA,RNA和蛋白质。

  5.适用于生产瞬时和稳定的蛋白质。

  6.可用于体内转染

  1.需进行条件优化(一些细胞系对阳离子脂质体较敏感)。

  2.有些细胞系不容易转染。

  3.血清的存在干扰复合物的形成,导致低转染效率。

  4.培养基中血清的缺失会增加细胞毒性。

  电穿孔法

  1.原理简单。

  2.条件优化后可产生重复性的结果。

  3.不需要载体。

  4.不限制细胞类型和条件。

  5.条件优化后可以快速转染大量细胞。

  1.需要特殊的设备。

  2.需要优化电转脉冲和电压参数。

  3.对细胞伤害很大。

  4.细胞死亡率很高因此需要大量细胞

  会不可逆转地损坏细胞膜,溶解细胞。

  优缺点的比较:

图例

  原理:利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞

  实验步骤:将细胞悬浮于点穿孔缓冲液中,制备细胞 → 在特定缓冲液存在的条件

  下,对细胞施加合适的电脉冲 → 电脉冲在细胞膜上形成电势差,形成临时孔,使核酸进入细胞 → 使细胞恢复生长状态,复苏 → 分析细胞瞬时基因表达或沉默情况。

  那么实验中细胞转染率低下的原因是什么呢?我猜你不知道,现在我们一起来看看!

  影响转染试验的因素:

  转染试剂跟细胞系不匹配

  转染试剂跟细胞系也是讲究配合默契的,使用同一种试剂,不同细胞系转染效率通常不同。但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然,最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。

  细胞状态变化

  因为有些细胞系是不稳定的,可能随着培养时间的改变,培养条件的不同,不同的选择压力,可能引起不同的克隆选择。因此就算是同一个细胞系,在不同条件下转染能力的差异可能会

  很大

  (1)转染试剂与细胞不匹配

  细胞转染最适合的不是原代细胞,也不是传代很多次的细胞。这是因为细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到对数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。

  (2)把握时机

  没错!转染也有适当的时机,相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言,细胞都在转染当天或前一天种板。

  同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态,如癌细胞数量过多,互相叠加,营养物质耗竭,代谢废物积聚,转染率低下也是很正常的!

  因此,一定要在最适细胞密度时转染,才能获得较高的转染率。不同的转染试剂,要求转染时的最适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异。

  (3)微生物来捣乱

  培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。各种污染都会导致产生错误的结果。

  (4)交叉污染

  如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞,很同意发生“细胞串门”的现象,造成交叉污染。

  转染方法

  不同转染试剂有不同的转染方法,但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法,但也要注意,因不同实验室培养的细胞性质不同,质粒定量差异,操作手法上的差异等,其转染效果可能不同,应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。

  (1)血清

  转染后未及时加入血清,会导致细胞大量死亡。一般要在转染后的4-6小时换液且换为有血清的培养基。也可以在原来的无血清培养基里面滴加血清。这个时候,最好不要换液,不要打扰细胞,让它安安静静地休息。但是也不能过早加入血清。过早的话,会引起未转染的细胞疯狂生长。那么,什么是最佳时机呢?在20%的细胞变圆的时候,就是加血清的最佳时机。

  不过要特别注意:血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响细胞生长,因此也会影响转染效率。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。

  (2)DNA质量

  DNA质量对转染效率影响非常大。一般的转染技术(如脂质体等)基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。

  载体构建

  转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)也影响转染结果。因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。

  所以转染用的质粒首先要保证数量,一般为2 μg以上。质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质,也会影响转染效率。这个时候,就应该对质粒进行纯化和浓缩。


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