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细胞复苏有什么注意事项,附带具体操作流程八个步骤

2022-09-19 10:44:48
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  开学季也是细胞们的复苏季,如果你对于细胞复苏还没有做到胸有成竹的话,快收藏这篇文章,在每一次复苏前都温习一遍吧。

  细胞复苏就像是蛋炒饭一样,最简单也最困难,只要有一步差池,就会导致细胞受损乃至死亡,从而整个实验失败!

  细胞复苏的第一要点就是快速融化,要尽可能快的将细胞从-178℃解冻至37℃,尽可能避免冰晶缓慢融化时进入细胞再形成结晶,对细胞造成损伤。

  具体操作流程共有八个步骤:

  ① 操作准备

  1) 将无菌超纯水加热至37℃保存在无菌玻璃瓶中备用;

  2) 细胞实验室预先常规消杀,用紫外线照射30min以上,并用75%酒精擦拭超净台以及各类器材,保证操作环境无菌;

  3) 将各类需要使用的枪头、离心管、培养瓶以及废液缸等高温高压灭菌后有序摆放在超净台桌面。

  ② 细胞转移

  1) 根据细胞冻存时保存的编号确定细胞存放的位置;

  2) 穿好防护设备后将细胞从液氮中取出,核对细胞编号;

  3) 将细胞迅速转移至操作空间,如步行距离超过1min,需准备干冰运输。

  ③ 细胞解冻

  1) 迅速将细胞冻存管投入37℃的无菌超纯水中快速摇晃解冻;

  2) 解冻1-2min后等液体完全溶解后,用酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再放入超净台内。

  ④ 离心清洗

  1) 将细胞溶液加入完全培养基完全吹打混合后平衡;

  2) 将离心管以3000r/min,离心3min,重复清洗两次去除DMSO。

  ⑤ 悬液制作

  1) 将上清液弃去后重新加入10ml完全培养基;

  2) 通过移液枪完全吹打混合后制成细胞悬液。

  ⑥ 计数观察

  1) 取适量悬液进行染色计数,计算细胞活力、活率;

  2) 显微镜下观察细胞,确定细胞具体复苏情况

  3) 细胞浓度需保持在5*105为适宜。

  ⑦ 培养细胞

  1) 将观察过后适宜培养的细胞分装在各个培养瓶中;

  2) 将各个培养瓶标记后放入37℃,5%CO2培养箱内24-48h后换液或传代。

  ⑧ 记录时间

  1) 将培养瓶中的细胞记录时间,方便之后换液传代记录。

  细胞复苏小贴士TIPS:

  1. 操作液氮时需要做好完全防护措施,避免直接接触到液氮造成伤害。

  2. 取出冻存管后需要检查是否密封,如果密封不完全会导致液氮进入管内解冻时出现炸管情况。

  3. DMSO在常温下会对细胞产生毒性,解冻要迅速,解冻后需要尽快加入少许培养基稀释后离心。

  4. 每次移液后需要更换枪头,避免造成溶液交叉污染。

  5. 解冻前后的培养基血清需要保持一致,如有更换需要进行梯度更换。

  判断细胞复苏的成功的关键,就是看细胞复苏后的存活率以及之后的生长情况,以贴壁细胞为例,复苏后细胞贴壁率能达到95%以上,就说明细胞活性好,复苏操作流程达标。

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