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【细胞培养】贴壁细胞培养基的选择与使用

发布时间:2022-09-17 10:27:14 阅读:14232次 来源:知乎

【细胞培养】贴壁细胞培养基的选择与使用

  一、复苏

  复苏细胞要快速解冻

  1、水浴锅加热至37℃。

  2、冻存管从液氮或者深度冰箱中取出,立即投入37℃,轻轻晃动至融化取出,酒精棉球擦拭后放入超净工作台内。

  3、使用移液器吸出细胞悬液至装有10ml培养基的离心管中,1500转/分钟,5分钟。整个操作速度尽量要快,以减少细胞在含有冻存液的培养基中存放的时间。

  4、移液器吸取上清液,加1ml培养基重悬细胞后,将细胞悬液加入5ml培养瓶,培养瓶加培养基至5ml。操作过程尽量轻柔。

  5、在培养瓶侧面标记细胞品种、实验日期等,放置细胞培养箱中培养,隔日观察细胞是否贴壁成活。

  二、培养基

  培养基的选择依细胞种类而定。贴壁细胞一般使用DMEM培养基。

  1、DMEM-高糖(标准型)

  含葡萄糖4500mg/L,适用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。附着性较差,但是又不希望它脱离原生长点的克隆培养,也能够用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。

  2、DMEM-低糖(标准型)

  含葡萄糖1000mg/L,用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养,特别适用于生长速度快,附着性较差的肿瘤细胞的培养。

  3、DMEM/F12

  DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂,含有很多微量元素,和DMEM以1:1结合,称为DMEM/F12培养基(DMEM/F12medium),作为开发无血清配方的基础,这就利用了F12含有较为丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。DMEM/F12培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞的培养。后来经过改良,在DMEM/F12(1:1)中加入15mMHEPES缓冲液,以增加其缓冲能力。

  三、血清

  一般选用血清种类可以根据ACTT及实验需求来选择。

  1、我国对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中突出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。血清分为:

  a) 新生牛血清(新生的小牛10-14天内取血);

  b) 小牛血清(10个月内的小牛取血);

  c) 胎牛血清(剖腹取出胎儿制成的)。

  2、三种血清之间的区别:

  三种血清的成份,总体没有明显差别。胎牛血清品质最高。胎牛血清与新生牛血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。因为生长发育的需要,有些成分在小牛出生后会发生一些变化,胎牛血清中的部分功能蛋白与小牛血清中的含量有差别。

  3、血清保存和使用的注意事项

  血清应保存在-5℃至-20℃,若存放4℃不可超过一个月。解冻血清时,应先将血清置于2-8℃冰箱,并经常摇匀使之溶解,然后至室温放置使之升温,不可直接置于37℃水浴锅或温箱中。如若放在37℃解冻,颜色加深,粘稠度也增加,血清在解冻和热灭火后,按用量分装,-20℃保存,使用时避免反复冻融。

  四、传代

  1、实验准备,超净台喷洒酒精,紫外照射30min。准备好培养瓶/皿,离心管,10%DMEM,0.25%胰酶,D-hanks液等,带上手套,口罩等。

  2、倒去旧培养基,用D-hanks液清洗一遍,去除沉积的死细胞等。

  3、加入2ml 0.25%胰蛋白酶消化液,消化2~3min,倒置显微镜下观察,待细胞单层收缩突起出现空隙时,倒去酶液。

  4、加入1~2滴管含有血清的培养液,反复吹打细胞,使其成细胞悬液。

  5、以1:2或1:3进行分装,补充新鲜培养基,并在培养瓶上做好标记,注明代号、日期,轻轻摇匀,37℃CO2培养箱培养。

  6、细胞培养24h后,即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。

  7、贴壁细胞的生长必须仔细监测以确保细胞保持健康。根据细胞类型,很多贴壁细胞在其达到70-90%密度,也就是覆盖了培养容器表面的70-90%时需要传代。这些细胞系虽然保留了原细胞源的很多特征,但是每次传代也会使它们开始产生一些扩增细胞的特有特性。因此,对任何一个特定细胞系,要考虑限制传代的次数。

  8、很多贴壁细胞系可天然附着于无涂层的塑料上。因此,塑料细胞培养板如培养皿或六孔板经常用于传代细胞。塑料的细胞培养瓶也经常用到,如T25的细胞培养瓶,常用于扩增培养数目少的细胞或者开始培养生长缓慢的细胞系。T75细胞培养瓶常用在培养扩增速度较快的细胞系或用于生长超过T25培养瓶容量的大量细胞。

  9、在转移贴壁细胞时,要先剪切掉细胞上与和塑料结合的蛋白。因此,消化酶胰酶常用于消化细胞。控制胰酶消化的时间很重要,因为如果处理时间过长会损坏细胞表面的蛋白。

  10、细胞培养液能中和胰酶。所以在胰酶消化前常用磷酸缓冲液或PBS洗涤细胞。EDTA,一种钙螯合剂有时候也用于提高胰酶的蛋白水解功能。

  11、为扩增细胞克隆,将新鲜传代的细胞培养于细胞培养箱中,选择适合该细胞生长条件,通常为温度37度,二氧化碳5%和湿度95%。


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