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培养细胞自然纯化和人工纯化方法

发布时间:2022-08-11 10:22:53 阅读:12262次 来源:百度学术

  体外培养细胞源于动物机体,而机体内的细胞都混杂生长,每一种组织都有血管和间叶组织,因此,从体内取得的培养材料所做的原代培养,绝大多数都是各种细胞混合生长。其主要表现为两大类,即上皮样细胞和纤维样细胞。在体外培养的细胞中即使都是纤维样细胞或上皮样细胞,它们也有种类的不同,如纤维样细胞包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。而利用体外培养细胞进行实验研究都要求采用单一种类细胞,这样才能对某一细胞的功能、形态等的变化进行研究,因此培养细胞的纯化就成为体外培养细胞实验研究的重要一步。

  细胞的纯化一般分为自然纯化和人工纯化两大类。可根据不同细胞种类、来源、实验要求和目的而选择不同的纯化方法。下面主要介绍一些基本的方法。

  一、自然纯化

  自然纯化即利用某一种类细胞的增殖优势,排挤其他细胞生长,靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞,去除其他细胞,达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法人为的选择细胞,时间长,多数情况下,剩下的都是成纤维细胞,因此,仅有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法,自然纯化而建立细胞系。

  二、人工纯化

  利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件,抑制其他细胞的生长,从而达到纯化细胞的目的。

  1. 酶消化法

  ①概述:由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,成纤维细胞对胰蛋白酶比较敏感,而上皮细胞对胰蛋白酶的耐受性较高,因此,在消化培养细胞时,成纤维细胞先脱壁,而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁,特别是原代培养和培养早期,这种差异尤为明显,因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法,将上皮细胞和成纤维细胞分开达到纯化细胞的目的。

  ②方法:采用普通消化传代方法,将0.25%胰蛋白酶注入培养瓶内两次,每次加1 mL(25 mL培养瓶),稍加摇动让胰蛋白酶流过所有细胞表面,然后倒掉。盖好瓶盖,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现纤维样细胞变圆,部分脱壁,立即加入2mL有血清培养液,终止消化。用弯头吸管轻轻吹打纤维样细胞生长的区域(可事先在显微镜下用记号笔在培养瓶上画出记号)。吹打过程中不要用力,也不要吹上皮细胞生长区域。吹打结束后,再用少量培养液漂洗一遍,然后加入适量培养液继续培养,也可重复上述操作再进行一次,或隔几日后或下次传代时,再进行上述操作。经过几次处理可以将成纤维细胞去除或将两者分开。

  2.机械划除法

  (1)概述:原代培养成功后,上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现,混杂生长。这种混杂生长常常分区呈片,每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞的区域,而保留需要的。

  (2)方法:将要纯化细胞的培养瓶,放在倒置显微镜监视下进行。用弯头滴管在不需要生长的细胞区域推划,使细胞脱壁悬浮在培养液中,注意不要伤及所需细胞;推划后用培养液冲洗两次,即可加培养液继续培养;数日后如发现不需要的细胞又长出,可再进行上述操作,这样反复多次可以纯化细胞。操作过程要严格无菌操作,防止污染。

  3.反复贴壁法

  (1)概述:成纤维细胞与上皮细胞相比,其贴壁过程快,大部分细胞常能在10~30 min完成附着过程(但不一定完全伸展);而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定,稍加振荡即浮起。利用不同细胞贴壁速度不同的特点,经过反复贴壁,可以将早期传代培养中的成纤维细胞和上皮细胞分开。

  (2)方法:将细胞悬液接种到一个培养瓶内(最好用无血清培养,因为在无血清支持下,上皮细胞贴壁更慢)静置20 min;在显微镜下观察,见细胞部分贴壁,稍加摇荡也不浮起时,将培养液连同尚未贴壁细胞一起倒出或吸到另一培养瓶;继续培养或重复上述操作,将上皮细胞和成纤维细胞逐步分隔开。

  4.克隆法

  在同一细胞系中,存在不同的细胞株,它们的功能和生长特点仅略有不同,要纯化出某一种细胞,用上述方法常不能将同一细胞系的不同株分开,可采用细胞克隆的方法。

  具体过程是采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞,使之分别生长成克隆,然后对每一克隆进行测试,选择出所需要的克隆。

  5.培养基限定方法

  某些细胞在生长过程中必须存在或去除某种物质,否则将无法生长,而其他细胞与之相反。可以利用这种技术来纯化细胞。如杂交瘤技术中常用的HAT培养液,就用来筛选杂交瘤细胞而抑制其他细胞。

  6.流式细胞仪分离法

  流式细胞仪可根据细胞核酸含量、某些物质含量或细胞结构大小等参数来将细胞分离成不同的群体。


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