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普通PCR和荧光定量PCR的引物设计,有什么相同点和不同点呢?

2022-08-08 10:34:31
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  说起引物,大家都再熟悉不过了。引物,在核苷酸聚合作用的起始时,可以刺激合成另一种大分子,并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中,引物是一段短的单链RNA或DNA片段,可结合在核酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。无论是做普通PCR还是荧光定量PCR,设计合适的引物是非常关键的一步。

  普通PCR和荧光定量PCR的检测方式具有较大的差别。荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光,普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR最终产物量。荧光定量PCR可以通过扩增曲线进行精确定量,普通PCR则是通过电泳的方式进行定性分析。那么在普通PCR和荧光定量PCR的引物设计方面,有什么相同点和不同点呢?今天小编就给大家汇总一下。

图例

  相同处:

  ▶ 序列的查找是一致的。

  ▶ 序列选取应在基因的保守区段。

  ▶ 选取合适的扩增片段大小。

  ▶ 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对。

  ▶ 避免引物自身形成环状发卡结构。

  ▶ Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%。

  ▶ 引物之间的Tm相差避免超过2℃。

  ▶ 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。

  不同处:

  荧光定量PCR 引物

  ▶ PCR产物长度:要求在300bp以内,一般首选80-150bp之间。

  ▶ 引物特异性:对引物要求高,尽量减少引物二聚体的产生,熔解曲线要求单一产物。

  ▶ 扩增效率:荧光定量 PCR的目的是进行定量或者相对定量,扩增效率应在90%—110%之间。

  ▶ 多对目的基因同时扩增,文献上查来的引物条件会不同,需要设计尽可能条件一致的引物。

  ▶ 目的基因含量比较低时,需要设计灵敏度比较高的引物。

  普通PCR 引物

  ▶ 普通PCR的扩增长度,根据实验的要求不同,一般是从150bp到几千bp不等。

  ▶ 相对于荧光定量PCR,普通PCR对二级结构要求较低。

  ▶ 对扩增效率要求不高。

  ▶ 可以选用梯度PCR仪,选择不同退火温度,对引物退火温度要求不需要一致。

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