细胞培养环境、设备、耗材与试剂

　　环境：细胞培养需要创造一个尽量无菌的环境，所以基本要求是一间密闭的带有空气净化系统的实验室。实验室要安装能够进行表面杀菌的紫外灯，一般装置在室内顶部，与日光灯分开控制。

　　设备：一般的细胞培养需要二氧化碳细胞培养箱，达到细胞实验操作要求的超净台，倒置显微镜，液氮罐，冰箱，水浴锅，离心机，微量移液器等。

　　耗材：基本的细胞实验耗材包括酒精灯、脱脂棉花、封口胶、细胞培养瓶、细胞培养皿、移液管、 50ml离心管等。耗材可以购买细胞培养专用的一次性耗材，也可使用长久性的玻璃器皿。但是如果是使用长久性的玻璃器皿，必须将其用牛皮纸包裹好，然后经过湿热高压灭菌和灭菌后烘干。牛皮纸在放进超净台时才能拆除。

　　试剂：根据培养的细胞种类的不同，需要的试剂也不同。基本要求包括培养的细胞对应的培养液，胎牛血清，L谷氨酸，双抗（青霉素和链霉素），0.25% 胰酶以及PBS。

　　试剂可以通过生物公司订购，其中双抗、胰酶和PBS也可以自行购买原料配制。1、配制双抗时要用灭过菌的双蒸水，用一次性无菌注射器进行配制，整个配制过程要在超净台内操作。

　　配制胰酶时要使用灭菌后的双蒸水，配制好可以用带0.22微米微孔滤膜的过滤器进行过滤灭菌，整个过滤灭菌过程要在超净台内操作。

　　配制PBS可以使用不灭菌的双蒸水，配制完成后再经过湿热灭菌。

　　部分试剂的配方

　　100×L谷氨酸：L谷氨酰胺0.2M

　　10×PBS：1000ml中含NaCl 8.5g，Na2HPO4.12H2O 30.8g，NaH2PO4.2H2O 2.8g

　　100×双抗：青霉素10000U/ml，链霉素10000ug/ml

　　胰酶：0.25%胰酶，0.03EDTA

　　细胞完全培养液的配置

　　细胞完全培养液，以293细胞为例，需要含10%胎牛血清、2mmol/L的L谷氨酸的DMEM培养液。

　　配置好的DMEM培养液，根据实验要求的不同，选择是否加入双抗。双抗终浓度为100单位/ml。

　　细胞培养实验基本操作要求

　　每天应该对细胞实验室进行半小时的紫外照射灭菌。紫外辐射对人体有害，灭菌时，人员不能进入细胞实验室。

　　进入细胞实验室操作的人员，应该身着消毒过的白大褂，更换消毒过的拖鞋，操作有毒试剂要带好手套。外来带入的物品，都要经过紫外照射或者酒精擦拭的表面灭菌。

　　裸手进行细胞操作，则要在操作之前用消毒液洗手，并在将手伸进超净台前用酒精擦拭全部手部皮肤。带橡胶手套进行细胞操作，在将手伸进超净台前也要用酒精擦拭手套的整个外表面。

　　试剂要按储存要求保存，在超净台内打开过一次的试剂，储存前要用封口膜封住瓶口，并最好在封口膜上表明打开日期。

　　使用超净台之前，应该将超净台的机玻璃板合上，打开超净台紫外开关进行半小时的紫外杀菌。超净台紫外灭菌完毕后，应关闭紫外开关，打开超净台通风开关，然后才能打开有机玻璃板。一般在使用超净台时，有机玻璃不能离台面太远，保持在20cm以内。

　　超净台灭菌以后，任何拿进超净台的物品都要用酒精擦拭物体的全部表面，然后在酒精未干之前放进超净台。要使用到的细胞培养耗材可以在超净台灭菌前放入其中，跟超净台一起灭菌。而细胞培养要使用到的试剂则不可以放入超净台接受紫外照射。

　　细胞实验要使用到的直接接触细胞的试剂，一般要在37度水浴锅中预热半小时，使其温度接近37度。

　　细胞离开培养箱被进行操作的过程不宜过长，否则由于外界温度和二氧化碳浓度的不适，会导致细胞状态不好甚至死亡。

　　细胞培养用的器皿，包括培养瓶、培养皿等等，要对着酒精灯的火焰打开开口，操作过程开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。细胞培养使用的试剂，在酒精擦拭试剂储存器皿后带入超净台。打开瓶盖之前要再用酒精棉花擦拭瓶口，然后对准酒精灯火焰打开开口。操作过程整个开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。

　　操作过程最重要的原则是保持细胞和试剂无菌，并且避免细胞和试剂之间、试剂和试剂之间的交叉污染。比如已经将移液管伸入细胞瓶里吹打细胞，那么要再吸取新的培养液加到培养瓶中则不能再使用该移液管，一定要更换新移液管再去吸取新的培养液。尽量减少细胞和培养液暴露的时间。

　　细胞的传代和培养（以293细胞为例)

　　传代： 一般贴壁细胞长满培养瓶培养面积的90%左右就应该对细胞进行传代。贴壁细胞长满培养面，就会产生接触抑制，影响细胞的状态。

　　对着酒精灯火焰打开细胞培养瓶，用移液管小心吸去培养液，注意移液管不要碰到细胞层，吸液时可将细胞瓶稍微倾斜。

　　吸取2-3ml PBS漂洗细胞，去掉残余血清并平衡盐离子。具体操作为：将PBS从背对着细胞层的一侧加入，倾斜培养瓶，让PBS溶液覆盖整个细胞表面，之后再把PBS溶液吸去。移液管注意不能碰到细胞层。

　　吸取1-1.5ml 25%胰酶加入培养瓶，将细胞从培养平面上消化下来。具体操作为：将胰酶从背对着细胞层的一侧加入，倾斜培养瓶，让胰酶溶液覆盖整个细胞表面，默数5s之后迅速把胰酶溶液吸去，残留大约0.2ml胰酶在培养瓶中。移液管注意不能碰到细胞层。将培养瓶盖上，左右倾斜培养瓶，让残余的一点点胰酶溶液再和细胞层反应。1min后轻轻拍打培养瓶侧面。如果肉眼能看见细胞层慢慢从培养平面脱落，则消化成功。否则，再加一点点新胰酶，重复操作。

　　吸去2ml左右完全DMEM培养液加入培养瓶，用移液管吸取培养液和残余胰酶混合物对着培养瓶底壁进行吹打，使以消化的细胞全部脱离瓶壁并分散开来。

　　根据培养的需要确定传代细胞的数量，将细胞悬浮液吸取到新的培养瓶中，再加入适量完全DMEM培养液，并再次吹打细胞。（培养液最终以盖住整个细胞培养瓶的培养面，深度3-4mm，并且不会沾染到培养瓶瓶口为准）

　　最后给新培养瓶做好标记，在超净台内将盖紧的培养瓶瓶盖旋松半圈，然后放入培养箱。培养瓶瓶盖旋松是为了让培养箱内气体能进入培养瓶。

　　培养： 不同细胞的培养条件略有不同，293细胞的培养条件是37℃，5%二氧化碳。细胞培养液中一般含有碳酸氢钠，通过跟二氧化碳的作用来维持培养液的Ph值。培养液中一般用酚红作为Ph指示剂，如果二氧化碳不通畅，培养液偏碱性，则呈现暗红色。二氧化碳通常，培养液偏酸性，呈现橙黄色。培养液偏碱性，会造成细胞无法生长或死亡。所以可以根据培养液颜色来判断瓶盖是否拧得过紧。细胞如果长时间不传代，每隔3天应该给细胞换次培养液。

　　细胞的冻存和复苏（以293细胞为例）

　　冻存： 冻存的细胞应该是处于良好的状态。

　　按传代方法把细胞悬浮。

　　将悬浮的细胞进行1000转的低数离心，使细胞沉淀。

　　用含10%DMSO的完全培养基重新悬浮细胞，并把细胞混合液分装到冻存管中，管口最好用封口胶封住。

　　细胞逐步降温有两种方法：A.传统的先把盛放细胞混合液的冻存管放入4℃10分钟，然后放负20℃，之后是负80℃过夜，最后移入液氮罐保存。B. 把盛放细胞混合液的冻存管放入程序性降温盒，然后在盒子里灌满异丙醇，之后放入负80℃过夜，最后移入液氮罐保存。

　　复苏：

　　把从液氮罐里取出的冻存管迅速放入37℃的温水中，并不断摇晃冻存管，使其内部的细胞混合液融化。

　　将冻存管中的混合液移入15ml离心管中，打开冻存管之前要用酒精擦拭冻存管管口。在离心管内迅速加入10ml完全培养液，并轻轻吹打使细胞混匀。

　　1000转离心5分钟，弃上清，再加入10ml完全培养液，吹打混匀。

　　1000转离心5分钟，弃上清。加入6ml完全培养液，吹打混匀后移入培养瓶内正常培养。

　　第二天要给细胞换液。

　　细胞的计数和铺板（以293细胞为例)

　　计数：

　　将细胞计数板和盖玻片清洗干净，并用擦镜纸吸去表面的水滴。

　　把盖玻片盖在细胞计数板的计数区域。

　　将细胞按传代方法悬浮，反复吹打细胞悬浮液使细胞分散均。取15微升左右的细胞悬浮液加入细胞从盖玻片和细胞板贴合的边缘加入，使其慢慢充满盖玻片与细胞板之间的空隙，注意不要留有气泡。

　　把细胞计数板放至显微镜下进行细胞计数。细胞计数板有上下两个区域，每个区域包含9个大格，每个大格又被划分为16个小格。选取一个大格，计数格中的细胞总数。压线的细胞只算上侧和左侧，不算右侧和下侧。每个大格的体积是0.1μl，换算可得悬浮液的细胞浓度。

　　铺板（以24孔板为例）：

　　在24孔板每个板中加入0.5ml完全培养基。

　　将细胞悬浮液稀释至6×105个细胞/ml，然后用1ml的枪吸取0.5ml细胞，将手抬高至枪头离细胞板3到4cm，缓慢的逐滴滴入孔中。滴液过程注意对准同一个孔的不同位置，以便让细胞分散得更均匀。

　　每滴完一个孔后，应该盖上24孔板，将整个板在超净台平面，水平的前后左右的轻微振荡一下。注意不能把细胞液振到板盖或板子外面。

　　将接种好的24孔板放入培养箱培养。每个孔加入3×105个细胞，是使24孔板经过12小时培养就可以盖满整个底面的细胞数量，根据实验的不同要求，可以调整加入的细胞量。其他孔板按照底面积换算。