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细胞培养实验方法,细胞培养实验基本操作

发布时间:2022-07-08 10:29:48 阅读:14132次 来源:百度学术

  细胞培养环境、设备、耗材与试剂

  环境:细胞培养需要创造一个尽量无菌的环境,所以基本要求是一间密闭的带有空气净化系统的实验室。实验室要安装能够进行表面杀菌的紫外灯,一般装置在室内顶部,与日光灯分开控制。

  设备:一般的细胞培养需要二氧化碳细胞培养箱,达到细胞实验操作要求的超净台,倒置显微镜,液氮罐,冰箱,水浴锅,离心机,微量移液器等。

  耗材:基本的细胞实验耗材包括酒精灯、脱脂棉花、封口胶、细胞培养瓶、细胞培养皿、移液管、 50ml离心管等。耗材可以购买细胞培养专用的一次性耗材,也可使用长久性的玻璃器皿。但是如果是使用长久性的玻璃器皿,必须将其用牛皮纸包裹好,然后经过湿热高压灭菌和灭菌后烘干。牛皮纸在放进超净台时才能拆除。

  试剂:根据培养的细胞种类的不同,需要的试剂也不同。基本要求包括培养的细胞对应的培养液,胎牛血清,L谷氨酸,双抗(青霉素和链霉素),0.25% 胰酶以及PBS。

  试剂可以通过生物公司订购,其中双抗、胰酶和PBS也可以自行购买原料配制。1、配制双抗时要用灭过菌的双蒸水,用一次性无菌注射器进行配制,整个配制过程要在超净台内操作。

  配制胰酶时要使用灭菌后的双蒸水,配制好可以用带0.22微米微孔滤膜的过滤器进行过滤灭菌,整个过滤灭菌过程要在超净台内操作。

  配制PBS可以使用不灭菌的双蒸水,配制完成后再经过湿热灭菌。

  部分试剂的配方

  100×L谷氨酸:L谷氨酰胺0.2M

  10×PBS:1000ml中含NaCl 8.5g,Na2HPO4.12H2O 30.8g,NaH2PO4.2H2O 2.8g

  100×双抗:青霉素10000U/ml,链霉素10000ug/ml

  胰酶:0.25%胰酶,0.03EDTA

  细胞完全培养液的配置

  细胞完全培养液,以293细胞为例,需要含10%胎牛血清、2mmol/L的L谷氨酸的DMEM培养液。

  配置好的DMEM培养液,根据实验要求的不同,选择是否加入双抗。双抗终浓度为100单位/ml。

  细胞培养实验基本操作要求

  每天应该对细胞实验室进行半小时的紫外照射灭菌。紫外辐射对人体有害,灭菌时,人员不能进入细胞实验室。

  进入细胞实验室操作的人员,应该身着消毒过的白大褂,更换消毒过的拖鞋,操作有毒试剂要带好手套。外来带入的物品,都要经过紫外照射或者酒精擦拭的表面灭菌。

  裸手进行细胞操作,则要在操作之前用消毒液洗手,并在将手伸进超净台前用酒精擦拭全部手部皮肤。带橡胶手套进行细胞操作,在将手伸进超净台前也要用酒精擦拭手套的整个外表面。

  试剂要按储存要求保存,在超净台内打开过一次的试剂,储存前要用封口膜封住瓶口,并最好在封口膜上表明打开日期。

  使用超净台之前,应该将超净台的机玻璃板合上,打开超净台紫外开关进行半小时的紫外杀菌。超净台紫外灭菌完毕后,应关闭紫外开关,打开超净台通风开关,然后才能打开有机玻璃板。一般在使用超净台时,有机玻璃不能离台面太远,保持在20cm以内。

  超净台灭菌以后,任何拿进超净台的物品都要用酒精擦拭物体的全部表面,然后在酒精未干之前放进超净台。要使用到的细胞培养耗材可以在超净台灭菌前放入其中,跟超净台一起灭菌。而细胞培养要使用到的试剂则不可以放入超净台接受紫外照射。

  细胞实验要使用到的直接接触细胞的试剂,一般要在37度水浴锅中预热半小时,使其温度接近37度。

  细胞离开培养箱被进行操作的过程不宜过长,否则由于外界温度和二氧化碳浓度的不适,会导致细胞状态不好甚至死亡。

  细胞培养用的器皿,包括培养瓶、培养皿等等,要对着酒精灯的火焰打开开口,操作过程开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。细胞培养使用的试剂,在酒精擦拭试剂储存器皿后带入超净台。打开瓶盖之前要再用酒精棉花擦拭瓶口,然后对准酒精灯火焰打开开口。操作过程整个开口都要对着酒精灯火焰10cm范围内。

  操作过程最重要的原则是保持细胞和试剂无菌,并且避免细胞和试剂之间、试剂和试剂之间的交叉污染。比如已经将移液管伸入细胞瓶里吹打细胞,那么要再吸取新的培养液加到培养瓶中则不能再使用该移液管,一定要更换新移液管再去吸取新的培养液。尽量减少细胞和培养液暴露的时间。

  细胞的传代和培养(以293细胞为例)

  传代: 一般贴壁细胞长满培养瓶培养面积的90%左右就应该对细胞进行传代。贴壁细胞长满培养面,就会产生接触抑制,影响细胞的状态。

  对着酒精灯火焰打开细胞培养瓶,用移液管小心吸去培养液,注意移液管不要碰到细胞层,吸液时可将细胞瓶稍微倾斜。

  吸取2-3ml PBS漂洗细胞,去掉残余血清并平衡盐离子。具体操作为:将PBS从背对着细胞层的一侧加入,倾斜培养瓶,让PBS溶液覆盖整个细胞表面,之后再把PBS溶液吸去。移液管注意不能碰到细胞层。

  吸取1-1.5ml 25%胰酶加入培养瓶,将细胞从培养平面上消化下来。具体操作为:将胰酶从背对着细胞层的一侧加入,倾斜培养瓶,让胰酶溶液覆盖整个细胞表面,默数5s之后迅速把胰酶溶液吸去,残留大约0.2ml胰酶在培养瓶中。移液管注意不能碰到细胞层。将培养瓶盖上,左右倾斜培养瓶,让残余的一点点胰酶溶液再和细胞层反应。1min后轻轻拍打培养瓶侧面。如果肉眼能看见细胞层慢慢从培养平面脱落,则消化成功。否则,再加一点点新胰酶,重复操作。

  吸去2ml左右完全DMEM培养液加入培养瓶,用移液管吸取培养液和残余胰酶混合物对着培养瓶底壁进行吹打,使以消化的细胞全部脱离瓶壁并分散开来。

  根据培养的需要确定传代细胞的数量,将细胞悬浮液吸取到新的培养瓶中,再加入适量完全DMEM培养液,并再次吹打细胞。(培养液最终以盖住整个细胞培养瓶的培养面,深度3-4mm,并且不会沾染到培养瓶瓶口为准)

  最后给新培养瓶做好标记,在超净台内将盖紧的培养瓶瓶盖旋松半圈,然后放入培养箱。培养瓶瓶盖旋松是为了让培养箱内气体能进入培养瓶。

  培养: 不同细胞的培养条件略有不同,293细胞的培养条件是37℃,5%二氧化碳。细胞培养液中一般含有碳酸氢钠,通过跟二氧化碳的作用来维持培养液的Ph值。培养液中一般用酚红作为Ph指示剂,如果二氧化碳不通畅,培养液偏碱性,则呈现暗红色。二氧化碳通常,培养液偏酸性,呈现橙黄色。培养液偏碱性,会造成细胞无法生长或死亡。所以可以根据培养液颜色来判断瓶盖是否拧得过紧。细胞如果长时间不传代,每隔3天应该给细胞换次培养液。

  细胞的冻存和复苏(以293细胞为例)

  冻存: 冻存的细胞应该是处于良好的状态。

  按传代方法把细胞悬浮。

  将悬浮的细胞进行1000转的低数离心,使细胞沉淀。

  用含10%DMSO的完全培养基重新悬浮细胞,并把细胞混合液分装到冻存管中,管口最好用封口胶封住。

  细胞逐步降温有两种方法:A.传统的先把盛放细胞混合液的冻存管放入4℃10分钟,然后放负20℃,之后是负80℃过夜,最后移入液氮罐保存。B. 把盛放细胞混合液的冻存管放入程序性降温盒,然后在盒子里灌满异丙醇,之后放入负80℃过夜,最后移入液氮罐保存。

  复苏:

  把从液氮罐里取出的冻存管迅速放入37℃的温水中,并不断摇晃冻存管,使其内部的细胞混合液融化。

  将冻存管中的混合液移入15ml离心管中,打开冻存管之前要用酒精擦拭冻存管管口。在离心管内迅速加入10ml完全培养液,并轻轻吹打使细胞混匀。

  1000转离心5分钟,弃上清,再加入10ml完全培养液,吹打混匀。

  1000转离心5分钟,弃上清。加入6ml完全培养液,吹打混匀后移入培养瓶内正常培养。

  第二天要给细胞换液。

  细胞的计数和铺板(以293细胞为例)

  计数:

  将细胞计数板和盖玻片清洗干净,并用擦镜纸吸去表面的水滴。

  把盖玻片盖在细胞计数板的计数区域。

  将细胞按传代方法悬浮,反复吹打细胞悬浮液使细胞分散均。取15微升左右的细胞悬浮液加入细胞从盖玻片和细胞板贴合的边缘加入,使其慢慢充满盖玻片与细胞板之间的空隙,注意不要留有气泡。

  把细胞计数板放至显微镜下进行细胞计数。细胞计数板有上下两个区域,每个区域包含9个大格,每个大格又被划分为16个小格。选取一个大格,计数格中的细胞总数。压线的细胞只算上侧和左侧,不算右侧和下侧。每个大格的体积是0.1μl,换算可得悬浮液的细胞浓度。

  铺板(以24孔板为例):

  在24孔板每个板中加入0.5ml完全培养基。

  将细胞悬浮液稀释至6×105个细胞/ml,然后用1ml的枪吸取0.5ml细胞,将手抬高至枪头离细胞板3到4cm,缓慢的逐滴滴入孔中。滴液过程注意对准同一个孔的不同位置,以便让细胞分散得更均匀。

  每滴完一个孔后,应该盖上24孔板,将整个板在超净台平面,水平的前后左右的轻微振荡一下。注意不能把细胞液振到板盖或板子外面。

  将接种好的24孔板放入培养箱培养。每个孔加入3×105个细胞,是使24孔板经过12小时培养就可以盖满整个底面的细胞数量,根据实验的不同要求,可以调整加入的细胞量。其他孔板按照底面积换算。

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