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细胞增殖实验操作步骤(MTT法)

2022-07-02 10:24:57
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  (一)细胞增殖实验原理

  MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,

  5-di-phenytetrazoliumromide, MTT(噻唑蓝)为基础。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可以用DMSO来溶解,利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。

  (二)细胞增殖实验操作(实用于贴壁细胞)

  1.接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.

  2.:培养细胞:同一般培养条件,培养2-3天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

  3.显色:分别培养不同时间,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

  4.比色:选择570nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

  (三)细胞增殖实验结果

  以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增殖率等。

  【细胞增殖实验注意事项】

  1.选择适当得细胞接种浓度。

  2.避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在显色后尽量吸尽孔内残余培养液。

  3.设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。每组设定3复孔。

  4.MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。

  5.酶联免疫检测仪使用前应打开电源预热半小时。

  6.选择不同的波长,酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的选择相应的波长。

细胞增殖实验操作步骤(MTT法)

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