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THP-1细胞培养注意事项,常见问题与解决方法

发布时间:2022-06-18 10:20:00 阅读:11902次 来源:海星生物

  THP-1细胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液,有分化为多种巨噬细胞的能力,是各领域研究常用的细胞系之一。

  THP-1是人外周血的单核细胞系,最初来源于急性单核细胞性白血病患者。属于悬浮细胞,适合用于转染或感染实验。其表面抗原HLA型为:A2,A9,B5,DRw1,DRw2。

  细胞复苏

  1. 预热水浴锅至37℃

  2. 准备一个15mL离心管,加入2-3mL左右完全培养基待用

  3. 将细胞从-80℃冰箱或液氮中取出后,放进一次性PE手套中,立即投入水浴锅,迅速用力摇晃管子,使其1分钟内融化

  4. 酒精擦拭冻存管,进入生物安全柜,把融化的细胞悬液缓慢滴加到步骤2准备好的离心管中

  5. 1200rpm(约250g)离心3分钟

  6. 同时准备1个新的T25培养瓶,加入5mL完全培养基

  7. 去上清,新鲜培养基重悬细胞后滴加到步骤6的培养瓶里,放入培养箱

  小贴士:THP-1细胞复苏后通常需要3-5天恢复状态,建议复苏后48小时内不要进行操作。

  细胞冻存

  1. 预先配制好冻存液

  2. 细胞1200rpm(约250g)3分钟离心后

  3. 去上清,用配好的冻存液重悬细胞

  4. 转移入冻存管

  5. 冻存管放进程序冻存盒

  6. 冻存盒放进-80度冰箱过夜,再放液氮长期保存

  小贴士:由于THP-1是悬浮细胞,更易受到冻存影响,建议加大冻存密度,大约200万-300万/mL为宜,以提高复苏存活率。

  培养条件

  培养基:RPMI-1640+10%FBS+0.05 mM β-mercaptoethanol+1%P/S

  推荐传代比例:1:3-1:6,每2-3天换液一次

  培养条件:气相:95%空气+5%CO2,温度:37℃

  传代操作

  当细胞密度达到约8x10^5cells/ml左右时,即可进行传代。由于是悬浮细胞,可直接将细胞吸出,离心之后传代。传代最少浓度不应少于1x10^5 cells/ml。

  去掉培养皿中的培养基,加入PBS进行冲洗,并去上清;

  加入胰酶进行润洗,并去上清;

  放入CO2培养箱消化2-4min;

  加入完全培养基终止消化,并吹打均匀。

  注意事项

  1. 细胞养不好,可能的原因有,THP-1细胞特别依赖细胞浓度,ATCC上10 5到106每ML,是一个很高的密度,细胞少了就不太容易养好。

  2. 细胞株的来源很重要,如直接来源于ATCC(American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心)生命力要强于国内细胞库的。

  3. 注意细胞的密度一定要高,介于5×10^5—— 10^6/mL之间,增值的快。细胞数量太少,不适合THP-1生长,一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多,继续培养一天或者两天,培养基 严重泛黄,细胞数会增加。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。

  4. THP-1细胞适合在细胞Ph环境偏酸性环境生长,对培养基变化非常敏感,所以 尽量使用相同Ph的1640。

  5. 传代后切忌常移出培养箱观察,否则会影响细胞生长,状态变差,一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快,对于状态已经不好的情况,建议传代后3~4天再观察,一般4天时间培养基已明显泛黄,细胞数量巨增;1)THP-1细胞喜欢酸性条件,你不要老是换培养基。越酸的条件,细胞密度越大,细胞就长得越好;2)不要频繁换液,一般2-3次换液离心一次(只是补充培养基)3) 使用1640(ATCC推荐),注意加碳酸氢钠2.5g就可以了,宁酸勿碱; 4)注意冻存的时候密度大些,推荐用血清冻存。

  6. 复苏比较慢,建议开始用小瓶,不要用一次性的。

  常见问题

  1. 收货时细胞出现伪足,或是碎片较多怎么办?

  受到运输影响,悬浮细胞会短暂性出现形态改变的现象,如伪足等。通过传代培养,1周左右可以恢复正常。一些细胞在运输途中死亡而产生碎片,通过传代离心可以去除(见上文传代篇)。

  2. 培养过程中细胞发生贴壁怎么办?

  少量细胞贴壁属于正常情况,将细胞悬液转移至新瓶中即可。当贴壁细胞的比例高于20%,说明细胞生长环境有异常,需排查培养箱设置、培养基成分,以及培养器皿是否异常。

  3. 培养过程中细胞发生聚团怎么办?

  少量细胞聚团,呈葡萄串状,属于正常现象,特别是细胞密度较低时,易出现这种情况。更换血清品牌或增大血清比例(不超过20%)有助于解决聚团问题。不建议将聚团的细胞吹散,等待密度高时,会自己分散开。

  4. 培养基里一定要加β-巯基乙醇吗?

  β-巯基乙醇是一种常用的培养补充剂,有抗氧化的作用,可减少氧化应激对THP-1细胞的影响。当细胞密度过大但需要维持时,可适当增加巯基乙醇的比例(不超过标准量的1.5倍)。

  5. 镜下观察时,难以聚焦或估算密度怎么办?

  悬浮细胞会随着液体流动,不容易聚焦,静置5-10分钟使细胞沉底,之后在轻轻放上显微镜观察,将有助于聚焦和估算细胞密度。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1277.html

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