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实验外包:免疫组化实验难点

2021-08-23 02:49:44
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  免疫组化现在普遍应用于病理科研领域,其中有些难点一直困扰大家,而这其中的难点主要有:

  1、免疫组化中封闭血清的选择原则是什么?

  (1)膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体,造成后续结果的假阳性!

  (2)封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合,否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合,会造成背景。

  (3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗来源一致。

  2、免疫组化中抗体孵育条件的比较?

  (1)一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

  (2)二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索。

  3、免疫组化中一抗4度孵育后为什么要进行37度复温?

  (1)一方面,防止切片从4度直接放入PBS易脱片;

  (2)另一方面,使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

  (3)其实我更赞同后一种说法,因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后,直接用PBS洗没发生过脱片现象。当然,事实胜于雄辩!

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