免疫组化现在普遍应用于病理科研领域，其中有些难点一直困扰大家，而这其中的难点主要有：

　　1、免疫组化中封闭血清的选择原则是什么？

　　（1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！

　　（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

　　（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

　　2、免疫组化中抗体孵育条件的比较？

　　（1）一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

　　（2）二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。

　　3、免疫组化中一抗4度孵育后为什么要进行37度复温？

　　（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；

　　（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

　　（3）其实我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。当然，事实胜于雄辩！