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鉴定细胞死活的方法

发布时间:2022-06-11 10:30:17 阅读:1482次 来源:百度学术

  活细胞的识别在生物学和医学上具有重要意义。在细胞培养过程中,应随时记录细胞的生长情况,并经常测量细胞的存活率。在肿瘤细胞的研究中,为了测试各种药物对肿瘤细胞的杀伤力,还需要测量肿瘤细胞的存活率。在临床医学中,死细胞和活细胞的识别也被广泛使用。例如,为了测试男性的生育能力,精子细胞的活力是一种常见的方法。

  鉴定细胞存活的方法有很多,包括染色和仪器分析。染色法是鉴定细胞活性的常用方法,简单易行。而直接形态学观察用于鉴别细胞是活还是死,实验结果容易受操作者主观因素影响,存在一定误差。因此,在实际操作中经常使用一些仪器来进行准确的批量检测。

  识别死细胞和活细胞的不同方法有其特定的反应机制,但无论采用何种方法,它们都利用了死细胞和活细胞在生理功能和性质上的差异。

  常用的方法有染色法和仪器分析法。

  1 染色法

  染色法分化学染色法和荧光染色法,根据染色机理的不同,染料或使死细胞着色,或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括:

  活细胞和死细胞的细胞膜通透性差异:活细胞的细胞膜是选择性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质选择性通过;但细胞死亡后,细胞膜受损,通透性增加。台盼蓝常用于鉴别细胞的生死,就是利用了这一特性。台盼蓝又称锥蓝,是一种阴离子染料,不能穿透完整的细胞膜。所以台盼蓝染色后只能染色死细胞,活细胞不染色。甲基蓝也有类似的染色机理。细胞壁分离也可以鉴定植物的存活。

  酵母细胞的生死代谢差异:是亚甲蓝染料鉴定酵母细胞生死的依据。美蓝是一种无毒染料,其氧化形式为蓝色,还原形式为无色。由于在活细胞中代谢,细胞具有很强的还原能力,可以将亚甲基蓝由蓝色氧化变为无色还原,所以染有亚甲基蓝的活酵母细胞是无色的。而死细胞或代谢缓慢的老细胞,由于其非还原能力或还原能力极弱,使亚甲蓝处于氧化状态,从而被染成蓝色或浅蓝色。

  荧光素二乙酸酯(FDA)是一种常用的染料,用于鉴定植物和动物细胞以及植物细胞原生质体的存活力。它的染色机理也是利用了活细胞和死细胞的代谢差异:FDA本身不产生荧光,非极性,可以自由地穿入和穿出完整的细胞膜。当FDA进入活细胞后,在细胞内被脂肪酶分解产生一种极性荧光物质——荧光素,它不能自由穿透活细胞膜并在其中积累,从而使活细胞产生绿色荧光;不活跃的细胞不能产生荧光,因为它们不能分解FDA。

  此外,还有一些细胞器的专有染料。例如液泡染料中性红。中性红是一种低毒染料,能使活细胞空泡红色,而细胞质和细胞核不着色。死亡细胞的液泡不染色或淡染,染料分散在整个细胞中,细胞核和细胞质被染成红色。有时为了增加染色效果,可以将两种染料混合使用,如甲基蓝-中性红混合染色。

  2 仪器分析法

  可采用微电极技术(利用死活细胞膜两侧电位的差异)、全自动分析细胞记数仪和流式细胞仪等,可对细胞的死活进行精确的批量检测。

  德国INNOVATIS公司生产的全自动Cedex细胞存活率/细胞计数器/细胞分析仪是世界上第一台高分辨率、高清晰度扫描(专利)细胞分析仪。拥有全自动台盼蓝染色、显微CCD成像和CEDEX工作站软件,可用于制药、医疗、发酵、免疫、病理、毒性检验、生物技术等学科的研发和工业生产中的细胞计数与分析。自动分析结果、检测分析数据输出(11项):细胞总数、细胞总浓度(细胞/ml);活细胞数和活细胞浓度(细胞/毫升);死亡细胞的数量和浓度(细胞/毫升);细胞存活率(%);细胞的平均圆度;细胞的平均直径(μm);总速率);的细胞;细胞直径直方图;聚类直方图(聚集直方图);细胞圆度直方图;细胞生长时间图(培养时间图)。

  流式细胞仪常用的判断细胞生死的荧光探针有两类:一类是能通过活细胞膜进入细胞并发出荧光的物质。比如FDA可以被活细胞保留,发出黄绿色荧光,但如果细胞受损,就会从细胞中丢失,观察不到荧光。另一类不能穿透活细胞膜,但能对固定细胞和膜受损细胞的细胞核进行染色。例如,碘化丙锭(PI)和EB、溴化乙锭(EB)通常用作第二类荧光探针。碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜,不能对细胞膜完整的正常细胞或凋亡细胞进行染色。对于坏死细胞,细胞膜的完整性丧失,碘化丙锭(PI)可以对坏死细胞进行染色。目前,常用的细胞凋亡和坏死检测试剂盒含有Hoechst 33342和碘化丙锭(PI)两种荧光染料。当凋亡发生时,染色质会收缩,Hoechst 33342可以穿透细胞膜。染色后,凋亡细胞的荧光与正常细胞相比会明显增强。上述两种染料双重染色后,正常细胞呈弱红色荧光+弱蓝色荧光,凋亡细胞呈弱红色荧光+强蓝色荧光,坏死细胞呈强红色荧光+强蓝色荧光。

  另外,植物细胞的质壁分离试验可以用来见证植物细胞的存活,通过观察细胞质的流动性可以鉴定细胞的存活。

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