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多色动物:使用荧光蛋白了解单细胞行为

发布时间:2022-05-25 10:44:21 阅读:18052次 来源:百度学术

  随机多色标记是神经科学和发育生物学中的一种流行技术。这种类型的细胞标记技术涉及引入含有不同颜色荧光蛋白 (XFP) 的转基因构建体,以标记器官或整个生物体。因为每个细胞都可以有多个将独立重组的转基因拷贝,所以当表达 XFP 的组合时,细胞可能会获得多种颜色中的一种。每个细胞在其整个生命周期中都保持相同的颜色,子细胞保持相同的颜色,从而可以随着时间的推移对细胞群进行命运映射。通过允许细胞在发育过程中持续发出荧光的工具,在生物体水平上跟踪单细胞动力学的能力成为可能。随机多色标签系统,许多基于 Brainbow,

  用 Brainbow 标记神经元

  Lichtman 小组于 2007 年开发了这项技术的原始迭代。用于标记小鼠小脑中的神经元,该团队恰当地将他们的技术命名为Brainbow。Brainbow 1.0使用荧光团 RFP(红色)、YFP(黄色)和膜系 CFP(青色)。Brainbow 1.1 添加了 OFP(橙色)(Livet 等人,2007)。

  Brainbow 使用Cre/lox 系统来标记神经元。编码荧光蛋白的基因与单个启动子串联组织,但仅表达直接跟随启动子的基因。Cre介导的这些基因中的一个或几个的缺失允许基因在构建体中更下游的表达。由于 RFP 和 OFP 分别位于 Brainbow 1.0 和 1.1 中启动子的下游,因此细胞会发出红色或橙色荧光,直到发生重组。

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  随着 Brainbow 1.0 的开发,已经开发了几个更精细的版本,它们在系统中使用的荧光蛋白的数量、稳定性和亮度方面有所不同。

  一个这样的系统是 Brainbow 2.0,它使用 Cre 来触发头对头对齐的两个基因的倒位。另一种变体,Brainbow 2.1,使用 Cre 来触发两个串联基因组的倒位,并删除其中一个基因对。因此,Brainbow 2.0 充当默认 RFP 和 CFP 之间的切换,而 Brainbow 2.1 从默认 GFP(绿色)切换到 RFP、CFP 或 YFP 荧光。在 Brainbow 2.1 中,GFP 被标记有核定位序列,使其能够定位到与 CFP 和 YFP 不同的细胞区域。

  Brainbow 的最新衍生产品Brainbow 3.0(Cai 等人,2013 年)结合了高度光稳定的荧光团 mOrange2、EGFP 和 mKate2(红色),以解决以前版本的 Brainbow 荧光强度低的问题。从 Brainbow 3.0 开发并使用相同的荧光标记,Brainbow 3.1 和 3.2(在同一出版物中描述)是独一无二的,因为默认情况下它们不是荧光的。相反,它们将截断的、非荧光形式的 YFP 作为转基因的默认状态,这样就需要重组来切除非荧光 YFP 并激活下游 OFP、GFP 或 RFP 的荧光。可以通过对截短的 YFP 进行免疫染色来检测表达构建体但不进行重组的细胞。

  在Thy1-Brainbow小鼠中,一些神经元表达了多达 16 个注入转基因的拷贝,每一个都可以重组以激活不同荧光蛋白的表达。因此,每个细胞都可以表达来自注入构建体的所有荧光蛋白的独特组合。在单个细胞中表达的荧光蛋白在整个细胞长度上保持其颜色,即使是长达 100 微米的轴突。

  Brainbow 系统的一些挑战是它不使用普遍存在的启动子,这意味着并非所有的细胞类型都可以被标记,并且虽然转基因的多个拷贝可以整合到细胞中,但这些 XFP 的表达水平对于所有人来说都不够强应用程序。为了解决这个问题,已经开发了类似的系统来跟踪各种细胞类型和生物体,并提高大脑随机多色标记的详细程度。

  用 dBrainbow 和 Flybow标记果蝇神经元

  基于Brainbow 1.0系统,果蝇Brainbow(dBrainbow; Hampel et al., 2011) 在成神经细胞阶段标记果蝇神经元,这意味着同一谱系的神经元将在成年果蝇中表达相同的 XFP 转基因。由于终止盒直接位于荧光蛋白基因的上游,因此需要在荧光发生之前进行 Cre 重组。Cre 重组酶可以与使用 Flp 重组的常见的现有飞行研究工具一起使用。除了构建体中的 XFP,dBrainbow 还包括与每个 XFP 融合的小表位。靶向这些表位并发出与融合 XFP 相同颜色的荧光的二抗可用于放大信号。活体动物的内源性荧光成像仅允许显示两种颜色。

  同样,Flybow将 Brainbow 2.0 改编为用于黑腹果蝇,并受 Flp 重组酶的控制。Flybow 中的 XFP 是膜系的,这使得该系统可用于细胞扩展的可视化,例如苍蝇视觉系统中的神经元,这在以前很难研究(Hadjieconomou 等人,2011)。

使用 Zebrabow 对斑马鱼进行细胞追踪

  在 Zebrabow 产生之前(Pan et al., 2011),Brainbow 还通过在胚胎阶段注射 CMV-Brainbow 构建体用于斑马鱼。该技术可用于通过将 Brainbow 置于神经特异性启动子的下游将 Brainbow 靶向神经元,或者可以通过在单细胞阶段注射 Brainbow 来标记整条鱼。Zebrabow 或“斑马鱼脑弓”是一组转基因斑马鱼系,可以对整个生物体或特定组织进行多色标记。使用称为Zebrabow-GateDest的质粒构建体引入 XFP在普遍存在的启动子下游包含 RFP、CFP 和 YFP。Zebrabow 是一种用途极为广泛的技术,因为可以通过 Cre 蛋白显微注射或将 Zebrabow 动物与可诱导的 Cre 系杂交,在发育中的鱼类中诱导重组。Schier 小组将Zebrabow 开发为一个利用 Brainbow 可能提供的多色标签的系统。

  使用 Confetti 鼠标追踪克隆细胞群

  对于哺乳动物系统,Clevers 实验室开发了Confetti 小鼠(Snippert et al., 2010),这是一种报告小鼠,当与表达适当Cre等位基因的小鼠杂交时,可用于追踪任何细胞类型。Confetti 小鼠在Rosa26基因座中包含 Brainbow 2.1 构建体,在 loxP “障碍”下,因此 XFP 仅在重组事件后表达。该小鼠的组织特异性 Cre 重组产生的细胞在特定细胞类型中随机表达核 GFP、膜 CFP、细胞质 YFP 或细胞质 RFP。

  Confetti 小鼠最初被用来描述肠隐窝中细胞的自我更新,从那时起它就成为了解细胞增殖的有力工具。

  Ubow 小鼠中的可诱导 XFP 表达

  另一种鼠类报告动物Ubow小鼠 (Ghigo et al., 2013) 是从 Brainbow 1.0-L 构建体开发的,它是 Brainbow 1.0 的变体,包含 RFP、CFP 和 YFP。在进入他莫昔芬诱导的泛素背景后,小鼠中表达 Cre 的每个细胞都经历了一次重组事件,导致转基因的每个拷贝都表达 YFP 或 CFP,而不表达 Cre 的细胞会用默认的 RFP 发出荧光。

  Ubow 结构随后被用于开发跟踪朗格汉斯细胞命运的系统。在 Ubow 小鼠中,表达 YFP、CFP 和 RFP 的细胞的频率不同。CFP++ 细胞的小种群规模使研究人员能够纵向绘制真皮中朗格汉斯细胞的周转图,并确定朗格汉斯细胞是通过特定而非所有朗格汉斯细胞的增殖来补充的,以产生增殖细胞的病灶。

  Tetbow 针对当前技术优化 Brainbow

  Tetbow (Sakaguchi et al., 2018) 通过结合Tet-Off系统来提高 XFP的表达,克服了 Brainbow 的 XFP 的低表达。Tetbow 亮度的增加使该系统可用于在多个视野中追踪数毫米长距离的神经元,而之前的 Brainbow 技术可用于仅在一个视野内区分神经元。Tetbow可以通过质粒的电穿孔或使用 AAV 载体在体内引入。

  Imai 实验室还开发了一个版本的Tetbow,它结合了化学标签而不是 XFP,以优化它以进行组织清除,这种方法使组织(例如大脑)透明,从而可以看到荧光神经元的 3D 结构。化学标签对组织清除方法的抵抗力更强,可以用合成荧光团标记,比荧光蛋白更稳定。有关更多详细信息,请查看开发 Tetbow 的研究人员的这篇博客文章。

  结论

  随机多色细胞标记系统允许比以往更详细地观察各种生物体中的单细胞动力学。随着科学家们继续开发这些技术的新迭代,期望看到使用更新、更耐光的荧光团并且可以与新的成像技术相结合的系统。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1189.html

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