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用 SapTrap 荧光标记内源基因

2022-05-25 10:25:17
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  自50 多年前发现GFP以来,荧光蛋白 (FP)的光谱不断增长一直是研究蜂窝系统的组织和功能的宝贵资源。FP 已被用于跟踪蛋白质定位、细胞结构、细胞内运输和蛋白质周转率。此外,通过设计与细胞器相关的 FP 融合,科学家们已经能够研究许多细胞过程,包括有丝分裂、线粒体裂变/融合、核输入和神经元运输。尽管 FP 能够发现许多细胞机制,但使用 FP 存在一些限制。荧光标记蛋白质的过度表达会导致蛋白质定位不当、蛋白质聚集或正常蛋白质功能的破坏,并最终误解蛋白质的细胞作用。

  自50 多年前发现GFP以来,荧光蛋白 (FP)的光谱不断增长一直是研究蜂窝系统的组织和功能的宝贵资源。FP 已被用于跟踪蛋白质定位、细胞结构、细胞内运输和蛋白质周转率。此外,通过设计与细胞器相关的 FP 融合,科学家们已经能够研究许多细胞过程,包括有丝分裂、线粒体裂变/融合、核输入和神经元运输。尽管 FP 能够发现许多细胞机制,但使用 FP 存在一些限制。荧光标记蛋白质的过度表达会导致蛋白质定位不当、蛋白质聚集或正常蛋白质功能的破坏,并最终误解蛋白质的细胞作用。

  避免过度表达荧光蛋白融合缺陷的一种方法是用荧光蛋白融合替换您感兴趣的基因的基因组拷贝。CRISPR基因组编辑可以帮助实现这一目标。该系统的强大之处在于内切核酸酶 Cas9 在由引导 RNA (gRNA) 序列指定的基因组位点产生 DNA 双链断裂 (DSB) 的能力。用户可以设计 gRNA 在特定基因组位点诱导断裂,并使用内源同源定向修复途径,可以在 DSB 插入新的用户定义的 DNA 序列(如 GFP)。CRISPR 使科学家能够标记和点亮感兴趣的内源基因,以更好地了解正常的蛋白质功能。然而,CRISPR 蛋白质标记确实有其局限性,尤其是在尝试进行高通量实验时。如果用户想要进行高通量基因筛选,单独生成包含每个插入标签的 gRNA 和同源臂修复模板既昂贵又耗时。此外,筛选包含新标记基因的转基因菌株仍然具有挑战性。大多数插入只能通过 PCR 等劳动密集型过程或通过评估视觉表型来检测。

  使用 SapTrap改进秀丽隐杆线虫荧光蛋白标记

  Jorgensen 实验室最近开发了一种称为SapTrap的模块化质粒组装工具包,以改进秀丽隐杆线虫中的 CRISPR 基因组标记。SapTrap 为科学家提供了一种方便的单管组装反应,以生成高通量靶向载体。这些载体可用于标记内源基因并同时引入选择标记以筛选修饰菌株。使用 SapTrap,用户首先为所需的 gRNA 靶序列设计寡核苷酸或合成 DNA,以及 5' 和 3' 同源臂修复模板(图 1,步骤 1 )。不需要 PCR 或克隆,因为用 SapI 消化目标载体会产生 2 个位点 - 第一个位点接受 sgRNA 目标序列用于 U6 启动子表达,第二个位点接受同源臂修复模板。

体质粒库

  SapTrap 包括一个预构建的供体质粒库,其中包含多种类型的荧光(EGFP、tagRFP、mCherry)和非荧光(Halo、SNAP)标签、一个用于轻松筛选插入事件的可选择标记(floxed Cbr-unc-119)以及多种连接器模块(标签和同源臂之间的连接器序列)。用 SapI 消化供体质粒可以释放标签、选择标记和连接器(图 1,步骤 2-3)。由于相同类型的供体质粒会产生相同的独特 SapI 5' 突出端,因此库中的连接器和标签供体质粒的不同组合可用于生成功能独特的修复模板。最终的连接反应正确组装了最终的靶向载体(图 1,步骤 4),同时注射靶向载体和 Cas9 表达质粒会将所需的遗传标签和标记序列插入靶向基因座。可选择标记可以通过Cre 介导的切除去除,以 进行无痕标签插入。

  除了 SapTrap 为标记单个基因位点提供的明显优势外,该工具包还提供了用于以组织特异性方式标记蛋白质的修复模板,以及用于在多个目标位点插入标签的 3 位点目标载体。SapTrap 载体可以轻松修改以标记数百个基因,从而生成强大的基因筛选库。

  额外的蛋白质标记系统

  对于那些不使用C. elegans的人,几个小组设计了模块化工具包,以帮助在其他模型系统(包括哺乳动物细胞)中标记基因组位点。

  由Hornung 实验室开发的 CRISPaint(CRISPR 辅助插入标记)允许用户轻松创建人类细胞内源基因的 C 端标记融合。要使用 CRISPaint,用户需要 3 个载体:1)靶向目标基因的 gRNA 载体,2)指定插入阅读框的质粒,以及 3)包含所需标签的载体,可以作为通用供体质粒。CRISPaint 工具包包括几种用于蛋白质标记的供体质粒,包括荧光素酶 (NanoLuc)、荧光蛋白(TagGFP2、TagBFP、TagRFP 和 T2A-TurboGFP-PEST)和小表位标签(HA、Myc、Strep tag II、AviTag、HaloTag ,间谍标签)。

  Foerstemann实验室开发了一种基于聚合酶链式反应 (PCR) 的系统,该系统允许用户生成包含所需 gRNA 与 U6 启动子的直接融合的质粒,以及包含同源臂和 N 或 C 末端的第二个质粒标签。然后将两个 PCR 反应混合并与 Cas9 表达载体一起转染。它们也可以直接导入稳定表达 Cas9 的果蝇S2 细胞系中。该 PCR 工具包提供 C 和 N 末端标记载体(例如 GFP、Flag、YFP、Strep、TEV-V5),可选择杀稻瘟素或嘌呤霉素。

  艾伦细胞科学研究所的研究人员最近开发了一系列质粒来荧光标记哺乳动物细胞中细胞结构的标记。这些质粒使用两侧有与感兴趣基因同源的长区域的荧光蛋白,以促进 CRISPR/Cas9 诱导断裂后的同源定向修复。在艾伦研究所最近的博客文章中了解更多关于这些构建体和它们用于创建的细胞系的信息。

  有关用于内源性蛋白质标记的其他 CRISPR/Cas 系统的更多信息,请访问我们的网站CRISPR/Cas 质粒 - 蛋白质标记。

  除了简单地监测蛋白质的定位和活性之外,还可以修改 CRISPR 标记系统来分析其他蛋白质特征。例如,Masato Kanemaki 的实验室开发了一种基于 CRISPR/Cas 的系统,用于使用生长素诱导型 degron (AID) 标签标记内源性蛋白质,以生成在向培养基中添加生长素后可以快速且可逆地降解的蛋白质。任何数量的调节序列,包括蛋白质增强子和阻遏物,都可以包含在修复模板中,以诱导蛋白质表达水平的改变。

  CRISPR 标记系统为用户提供了一种简单有效的方法来标记内源性蛋白质,以研究蛋白质表达、定位和蛋白质-蛋白质相互作用。此外,由于 SapTrap 等标记系统中包含的载体的模块化排列,科学家们将能够生成包含在内源基因座荧光标记蛋白质的全基因组文库,从而揭示以前未知的蛋白质功能。


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