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如何确定提取RNA的质量好坏,RNA提取实验方法技巧分析

发布时间:2022-04-28 10:33:10 阅读:1872次 来源:生物医学实验

  各位都知道,提取到质量良好的RNA(包括总RNA和mRNA,以下同)是非常困难,关于RNA的提取技术,我就不说了,为什么呢?或许各位非常关心呢,我是这样想的,我可以看到的资料或者是厂家的说明书,各位也同样可以看到的,内容当然都是一样的了,所以实验做的好不好,主要是心的投入多少的问题,所以希望大家自己多多思考啊!

  提取技术虽然不说了,但是我可以告诉各位如何准确确认RNA质量的有效方法(可能是最简单而有效的,如果你已经知道了,也请你不要笑话我孤陋寡闻了!)

  一、如何确认RNA的质量

  以下两种方法,相信大家都知道的:

  1)检测RNA溶液的吸光度

  280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)。

  1.82.0时,我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R值可能会大于2(一般应该是<2.2的)。当R<1.8时,溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显,你可以根据自己的需要决定这份rna的命运。当r>2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。

  2)RNA的电泳图谱

  一般的,RNA的电泳都是用变性胶进行的,但是根据我的经验,如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的,用普通的琼脂糖胶就可以了。

  电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量是好的。

  以上是我们常用的两种方法,但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶,用以上方法我们很难察觉,但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样,如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶,那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了,当然这时你的实验也就完了。

  下面,我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。

  3)保温试验

  方法很简单的,按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。

  时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法2中的条件),则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染

  如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰,那么你的实验应该是很难失败了!

  二、RNA提取实验方法技巧分析

  介绍不同种类的样本提取RNA时前处理的方式以及实验中应该需要注意的事项,提取RNA时我们经常遇到的问题是 :

  (1)RNA产量较低;

  (2)RNA有严重的盐类污染;

  (3)RNA有严重的有机溶剂污染;

  (4)样品降解等问题,下面我们就来一起探讨下。

  常用总RNA提取试剂

  异硫氰酸胍法和Trizol法是动物组织及动物细胞总RNA提取最常用的方法,异硫氰酸胍法操作简单快捷,适用于样本足够大的常规动物组织;Trizol法裂解能力较强,尤其适合小样本及特别难提取的组织,如兔子皮肤,动物结缔组织等总RNA的提取;另外Trizol作为一种通用型的裂解试剂,还可以用于植物组织、细菌、真菌等组织的提取。对于含多糖多酚的植物组织如油茶、茶叶、油菜等还可以使用CTAB法进行总RNA的提取。

  动物组织总RNA提取

  1、尽量选取新鲜的组织,如果不是新鲜的(最好在三个月之内-80℃冰箱或者在液氮中冻存的。在剪取组织时,不要拿到室温直接剪取,一定要放到冰盒上,尽量避免反复冻融。

  2、用干净的剪刀镊子剪取一小块组织,剪取样本时尽量剪组织中央的部位,或者先将大块的组织先从中间切开,然后再在新鲜切口的位置剪取样本。取下的组织要充分的剪碎,将剪碎的组织放到无RNA酶的EP管中,加入裂解液,剪碎的组织要充分接触裂解液,准备匀浆。

  3、正常组织选取绿豆粒大小(30~60 mg)的组织进行匀浆,如果组织中含有大量的蛋白、脂肪或者是紧密的纤维组织比如肝脏等,适当增减剪取组织的量(可选10~20 mg)。

  4、如果提取的是鱼肌肉,虾肉,海蜇等含水分较多的组织时则应当适当提高样本量用量(推荐100~200 mg)。

  5、条件允许的情况下,动物组织使用高通道组织匀浆机匀浆后即可直接进行提取步骤,如没有该设备。

  6、最后提取后得到的RNA一定要立即放到冰盒上,以减少RNA的降解。

  动物细胞RNA提取

  1、悬浮细胞:可直接离心后弃掉培养基,用无菌PBS清洗1~2遍后,再用适量PBS悬浮起来,然后再加入裂解液进行裂解。千万不要完全弃掉液体后,往沉淀细胞里直接加入裂解液,这样会使外表层的细胞裂解后释放的组蛋白包裹粘附在沉淀细胞外侧,从而限制沉淀内部的细胞与裂解液的接触,从而导致细胞裂解不彻底,降低RNA得率。

  2、半贴壁或贴壁不紧的细胞:弃掉培养基后,用PBS洗1~2次,然后直接吸取适量PBS用吸管或者枪吹打培养皿,把细胞吹下来,转移到无RNA酶的EP管中,加裂解液进行提取。

  3、贴壁细胞:需要先用胰酶消化,然后收集到无RNA酶的EP管中,离心去其上清,用PBS洗1~2次,去除多余的胰酶,以适量PBS重悬后继续进行提取步骤。

  植物RNA提取

  植物组织中,富含酚类化合物,或富含多糖,或含有某些尚无法确定的次级代谢产物,或RNase的活性较高。这些物质在细胞裂解后与RNA紧密结合形成难溶复合物或者胶状沉淀,很难将其去除。所以我们在提取植物组织时,要选取针对植物的试剂盒,试剂盒里的裂解液能有效解决多酚易氧化、多糖化合物与核酸分离等难题。

  1、植物的果皮、果肉、种子、叶片等要在研钵中充分研磨,研磨过程中液氮要及时补充,避免样品融化,研磨后的样品应迅速加入裂解液中震荡混匀,避免RNA降解。

  2、像水稻及小麦叶片等富含纤维的样本,则应适当减少提取用量,否则组织研磨及裂解不彻底,会使提取的RNA产量较低。

  3、含水分较多的植物组织例如石榴果实、西瓜果实、桃子果实等则应当适当提高样本量(可选100~200 mg)。

  4、植物组织,如植物叶片、根茎、坚硬的果实等材料一般建议使用液氮在研钵中彻底研钵成份,再继续进行提取步骤。常规的组织匀浆机对植物组织的匀浆效果可能不佳,一般不建议使用。

  RNA提取注意事项

  1、组织样本要尽可能的新鲜,避免反复冻融。

  2、提取时组织要充分研磨,组织量不宜过少,更不宜过多。

  3、加入裂解液后应给予充分的孵育时间,使样本充分裂解。

  4、在用Trizol法提取时,分层后吸取上清的原则是“宁愿少吸,不能多吸”,千万不能提取到中间层,否则会导致严重的基因组DNA污染。

  5、洗涤时洗涤液应充分浸润到管壁的四周,确保洗涤彻底。

  6、柱式提取法,洗涤完后除了对柱子进行空离后,还应当将吸附柱置于超净台内吹风5~10 min,使有机溶剂充分挥发干。

  7、柱式法最后洗脱时候,当加入DEPC水后还应孵育3~5 min,或者提前将DEPC水加热至60℃,可提高洗脱得率。传统的Trizol裂解异丙醇沉淀法最后RNA是用DEPC水溶解沉淀,则应当给予适当溶解时间,并用枪头不断吹吸离心管底部。

  RNA提取浓度不高或质量不佳原因及解决办法

  1、得率过低:提取样本过低总量不足或者提取样本过多裂解不彻底;应当使用适当质量的组织或细胞进行提取,样本前处理一定要做好,裂解应充分。

  2、基因组残留:Trizol法提取时,分层后吸取上清时吸到中间层会带来严重的基因组污染;分层吸取时应当格外小心,不要吸取到中间层。如果是采用柱式法提取,可选择含有DNase I的试剂盒进行提取,吸附在膜上的核酸直接用DNase I进行消化,可极大限度的降低DNA残留。

  3、RNA降解:可能是提取样本本身降解,或者是在提取过程中导致的降级;应当尽可能使用新鲜样本进行RNA提取,采集的样本应当及时置于液氮或者-80℃冰箱冻存,并减少反复冻融。在RNA提取过程中应当使用RNase/DNase free的吸头、离心管及其他材料,提取过程尽可能的快,提取后的RNA应置于冰盒上并及时放于-80冻存。如提取后的RNA需要进行凝胶电泳检测,则应提取好后立刻进行电泳,电泳缓冲液应更换新配制的。

  4、盐及有机溶剂残留:提取试剂中含有酚及胍盐,洗涤液中含有乙醇,在提取过程中裂解液吸弃不彻底,洗液没有充分晾干导致的,残留的盐及有机溶剂对后续的逆转录和PCR均存在不同程度的抑制作用,因此在提取过程中应充分去除组织裂解液,洗涤时应充分,使管壁四周均能被洗涤到,另外管子空离和吹风是必须的步骤,会进一步降低有机物残留。

  以上内容就是不同样本在RNA提取过程中的一些小技巧、注意事项及问题分析,希望能对你有所帮助。

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