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真核生物mRNA的分离纯化原理(目前常用的mRNA的纯化方法)

2022-05-09 10:44:43
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  【实验原理】

  真核生物的mRNA分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物,因此,高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA,理论上认为每克细胞可分离出5~10mg RNA。其中rRNA为75%~ 85%,tRNA占10%~16%,而mRNA仅占1%~5%,并且mRNA分子种类繁多,分子量大小不均一,表达丰度也不一样。

  真核生物mRNA有特征性的结构,即具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly(A)尾,通常用poly(A+)表示,这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化,提供了极为方便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

  一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚(dT)(即oligo(dT))纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,即可得到较纯的mRNA。

  目前常用的mRNA的纯化方法有:

  (1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法;

  (2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的  RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素;

  (3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。

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