蛋白挂柱后洗脱不下来主要是因为蛋白和柱子结合能力太强或者洗脱条件太温和，我们可以从以下几方面考虑解决问题。

　　1、洗脱条件太温和：重新摸索洗脱条件，增加缓冲液中咪唑浓度或者适当降低缓冲液pH以确定最佳的洗脱条件或者更、换缓冲液的成分（换成tris-HCl缓冲液）。

　　2、蛋白在柱子中沉淀：适当降低上样量或蛋白浓度，用咪唑线性洗脱。使用添加剂或者改变NaCl的浓度，或者在变性的条件下洗脱（加4-8M的尿素或者4-6M的盐酸胍）。

　　3、非特异性的疏水或者其他作用：在洗脱液中加非离子的添加剂（例如0.2%的Triton X-100）或者增加NaCl的浓度。

　　4、蛋白和柱子接触时间过长：可以减少蛋白和柱子的接触时间。

　　总结如下：

　　a. 可能原因：洗脱条件太温和 （组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）。

　　解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低 pH 来找出*的洗脱条件。

　　b. 可能原因：降低 pH 的方法洗脱的，若 pH 低于 3.5，会导致镍离子脱落。

　　解决方法：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。

　　c. 可能原因：蛋白已沉淀在柱上。

　　解决方法： 减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变 NaCl 的浓度，或在变性条件 ( 去折叠) 下洗脱 ( 用 4～8 M 脲，或 4～6 M 盐酸胍)。

　　d. 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应。

　　解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液 (如：2% Triton X-100) 或增加 NaCl 的浓度。