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提取外泌体的方法-外泌体的提取和鉴定

2022-04-21 10:31:03
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  近些年来,关于外泌体的研究如火如荼。外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。同时,不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能,可作为疾病诊断的生物标志物。来自华中科技大学同济医学院附属协和医院的崔老师,对外泌体提取积累了自己的心得,并将自己的研究成果发表在Bioactive Materials上。下文是崔老师的分享。

泌体提取之经验小结

泌体提取之经验小结

  要进行关于外泌体的研究,提取纯化外泌体一直是大家非常关注的问题。能否获得较高纯度的足量外泌体,直接关系着后续研究能否开展。虽然目前仍然没有能同时保证外泌体的含量、纯度和生物活性的提取方法,但是我们可以结合当前的实际情况,对外泌体提取做一些探讨和经验总结。

  超速离心(差速离心)法是目前最常用的外泌体提取方法,即采用低速离心、高速离心交替进行,可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单,获得的囊泡数量较多而广受欢迎。本人近期发表的论文中最后也是采用了这种方法。

  具体的步骤大家都比较熟悉,无论是提取血清来源的外泌体,还是细胞条件培养基来源的外泌体 ,大家都习惯于先将血清或者条件培养基收集后保存于-80℃的温度下,等达到一定量后,再批量进行超速离心。

  这样的话,大家会发现一个非常严重的问题,尤其是在拍摄电镜的时候——背景杂质很多,并且很多囊泡的形态不够典型,不是文献中描述的那种典型的双凹圆盘状或者茶托状。

  通过几次实验的对比,我大概发现了原因,主要是由于在冻存收集到培养基的时候,没有进行低速离心和普通高速离心。

  低速离心可以去除培养基中的未贴壁细胞、死细胞以及大的细胞残骸,而普通高速离心可以去除其中的大型细胞外囊泡。无论是未贴壁细胞、死细胞、大的细胞残骸,还是大型细胞外囊泡,在-80℃冻存及复温的过程中,都会发生破裂,产生小型的细胞膜碎片结构。

  这样的话,就导致了电镜背景很杂乱,难以达到高水平论文杂志期刊的要求。另外,还会导致这样一个矛盾现象,即蛋白定量中计算的外泌体产量虚高,而蛋白免疫印迹中外泌体标记物蛋白的含量却不高。

  因此,在这里推荐给大家一个小贴士

  就是在收集准备提取外泌体的条件培养基或者血清时,一定要提前做到低速离心和普通高速离心这一步,尤其是为了做透射电镜或者蛋白免疫印迹实验而提取的外泌体,一定要注意这一点。尽管过程比较费时,但是能生产出有用的结果才是更重要的。

  至于其他的外泌体提取方法,如密度梯度离心、色谱柱、超滤离心法、微流控芯片法、磁珠免疫法、多聚物沉淀法,我看到学校里面鲜少有人去尝试,毕竟更麻烦。但不同的方法各有优劣,大家可根据自己的实验,谨慎选用。

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