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一个简单的SDS-PAGE凝胶配方和完美凝胶的 10 步流延协议

2022-04-20 10:41:32
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  SDS-PAGE(代表十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)是联合生命科学家的技术。我们在研究期间都使用它来分离蛋白质分析物,因此,我们都需要一个好的 SDS-PAGE 凝胶配方。

  Bitesize Bio 上有一些很棒的文章,告诉您SDS-PAGE 的工作原理以及Laemmli 缓冲液的成分。还有一个解释在运行 SDS-PAGE 凝胶时是否使用恒定电流或电压。

  但是用于浇铸您自己的凝胶的 SDS-PAGE 凝胶配方呢?

  好吧,不再依赖贴在实验室墙上的折角、难以辨认(并且可能不正确)的纸张,因为我们为您提供了一个简单的配方,可以按照您想要的任何百分比制备SDS-PAGE 凝胶。

  我们还将快速了解 SDS-PAGE 凝胶成分的化学性质,并在出现问题时提供方便的故障排除指南。

  您的 SDS-PAGE 凝胶配方

  对于那些不了解的人,SDS-PAGE 凝胶以特定的丙烯酰胺百分比制备,以解析给定分子量的分析物。

  当我们说“丙烯酰胺”时,我们用它来表示丙烯酰胺和双丙烯酰胺(通常)比例为 37.5:1 的 30% w/w(即重量比)溶液。

  除此之外,请查看表 1,了解 4 x 0.75 毫米厚凝胶的 SDS-PAGE 凝胶配方表。

  表 1。SDS-PAGE 凝胶配方。

表 1。SDS-PAGE 凝胶配方。

  如果要制备 4 x 1.00 毫米厚的凝胶,请将 SDS-PAGE 配方中的所有内容乘以 1.5。

  如果您想制备 4 x 1.50 毫米厚的凝胶,请将 SDS-PAGE 配方中的所有内容乘以 2.0。

  专业提示!如果您在凝胶放入凝胶槽后难以确定样品的加载位置,请在浓缩凝胶中添加约 0.003% w/v 溴酚蓝以将其染成蓝色。

  帮助!我不知道要准备多少百分比的凝胶

  丙烯酰胺的最终百分比决定了您的凝胶能够分离的分子量分析物。

  除非您有大量使用 SDS-PAGE 凝胶的经验,否则您可能不知道多少百分比的凝胶适合您的目标分析物。使用表 2 为您提供指导。[2]

  表 2。使用 8–20% 丙烯酰胺制备 SDS-PAGE 凝胶时可以分辨哪些蛋白质大小的总结。

表 2。使用 8–20% 丙烯酰胺制备 SDS-PAGE 凝胶时可以分辨哪些蛋白质大小的总结。

  大多数实验室都可以使用丙烯酰胺,因为我们已经提到了 30% 的溶液,这意味着我们可以制备的最大凝胶百分比约为 22%(在没有水的情况下制备凝胶)。

  为了分离分子量极高或极低的分析物,您可能需要使用粉状丙烯酰胺和双丙烯酰胺。

  这样做可以让您自定义两种组分的比例,并选择具有适当分辨率的凝胶。除了说您可以单独或预混合购买粉状丙烯酰胺和双丙烯酰胺外,我们不会对此进行深入探讨。

  然而,在大多数情况下,8-20% 的凝胶是合适的。

  SDS-PAGE 凝胶浇注方案

  漏水的井,不稳定的凝胶。您现在有一个包含所有成分及其必要比例的 SDS-PAGE 凝胶配方,但您如何可靠地浇注凝胶?

  这是一个简单的 10 步凝胶浇注方案,绝对不会让您失望。

  浇铸完美 SDS-PAGE 凝胶的 10 个简单步骤

  收集所有浇注设备和两个大小合适的容器,例如两个 50 mL 烧杯,用于制备分离胶和浓缩胶。用一些有意义的东西给它们贴上标签,比如“R”和“S”,这样你就不会混淆它们了。

  用工业甲基化酒精 (IMS) 或乙醇溶液擦拭玻璃夹层板以清洁它们。组装铸造设备,使薄玻璃板在前面,带脊的厚玻璃板在后面,脊在两块板之间形成狭窄的间隙。这是您将凝胶混合物倒入的地方。

  将两种凝胶的所有成分( 10% APS 和 TEMED除外)倒入各自的容器中。APS 和 TEMED 在这个阶段被排除在外,因为聚合从它们加入的那一刻就开始了!密封包含浓缩凝胶成分的容器以防止蒸发。

  将 10% APS 和 TEMED 添加到溶解凝胶成分中并轻轻混合。将混合物立即倒入玻璃夹层板中,在半月板和前板顶部之间留出约 2.5 厘米,以容纳解析凝胶和样品梳。如果您不确定要留下多少空间,请将梳子插入一组空盘子并画一条线!

  在未聚合的分离凝胶上加入异丙醇(与凝胶成分不混溶)。让凝胶聚合 30–45 分钟。您可以通过轻轻倾斜浇注设备来检查凝胶是否已聚合。如果凝胶没有聚合,分离凝胶的顶部将与地面保持平行。

  倒掉异丙醇,用纸巾吸走多余的东西。用蒸馏水洗涤以除去任何残留的异丙醇。

  将 10% APS 和 TEMED 添加到浓缩凝胶成分中,混合并立即倒在分离凝胶上。为了简单起见,将玻璃夹层板一直填充到顶部。

  将梳子插入未聚合的浓缩凝胶中并使其凝固。梳子会置换一些未聚合的浓缩胶,这些胶会溢出。用一些纸巾把它擦掉。

  小心地沿垂直线取下梳子。这应该防止摇晃和倒塌的井。请注意,使用旧的和破旧的梳子时,端井很容易塌陷。

  立即使用或正确存放(见下文)以备后用。

  这里的一些额外指示将使您的生活变得更加简单。

  塑料巴斯德移液器适用于倾倒凝胶,并让您对添加的体积进行出色的控制。血清移液管也很有效。

  目标是在分离凝胶顶部和由梳子形成的样品孔底部之间放置大约 10 mm 的浓缩凝胶。这将为您提供蛋白质分析物之间的最佳分辨率。

  吸走异丙醇时,最好使用无绒抹布而不是蓝色卷纸。用于蛋白质印迹的滤纸也很有效。

  如果您想知道是使用 5 齿、10 齿还是 15 齿梳子,表 3 给出了所得凝胶每孔可以容纳的近似样品体积。

  表 3。使用 5 齿、10 齿和 15 齿梳子时 0.75、1.00 和 1.50 毫米厚的凝胶可以容纳的样品体积汇总。

表 3。使用 5 齿、10 齿和 15 齿梳子时 0.75、1.00 和 1.50 毫米厚的凝胶可以容纳的样品体积汇总。

  如果您想知道使用什么厚度的凝胶,这里有一些注意事项:

  较厚的凝胶不易撕裂。

  较厚的凝胶可以加载更多的样品。

  较薄的凝胶运行得更快。

  在大多数情况下,0.75 毫米厚的凝胶是合适的。

  如何储存您的 SDS-PAGE 凝胶

  在水龙头下弄湿一些纸巾,然后将其包裹在凝胶上。然后,挤掉多余的水,用保鲜膜把整个包装包起来。

  用凝胶百分比和厚度标记您的包装,将它们放入冰箱,并在几周内使用它们。

  为什么要浇铸您自己的 SDS-PAGE 凝胶?

  如果您阅读了上面的 SDS-PAGE 凝胶配方并想:“既然我可以购买预制凝胶,我为什么还要烦恼这些呢?” 我听到你了。

  但是有充分的理由自己铸造凝胶:

  你会省钱;

  您将减少塑料垃圾;

  你永远不会用完;

  您将始终拥有正确百分比的凝胶。甚至梯度凝胶!

  关于第 1 点,SDS-PAGE 凝胶中最昂贵的成分是 30% 丙烯酰胺溶液。每 0.5 升的成本约为 70-100 英镑。

  快速的数学时间!

  使用上面的配方表,如果您要专门制备 10% 丙烯酰胺凝胶,则每 4 块 SDS-PAGE 凝胶需要使用约 7 mL 的 30% 丙烯酰胺。

  因此,一瓶 0.5L 的 30% 丙烯酰胺可制成 4 x (500/7) = 285 块凝胶。每凝胶 0.25-35 英镑。

  我能找到的最便宜的预制凝胶(尽管看起来很粗略)每块凝胶的成本约为 7 英镑。

  您无需成为罗杰彭罗斯爵士即可确定哪个选项最便宜。

  我很欣赏 SDS-PAGE 凝胶配方中的其他成分也有与之相关的成本。然而,我假设这些成分已经在您的实验室中大量供应!

  认识演员:SDS-PAGE 凝胶的成分有什么作用

  您有没有想过您的 SDS-PAGE 凝胶配方中的成分实际上有什么作用?

  浓缩胶和 SDS 中 pH 值为 6.8 的 Tris 碱具有与在 Laemmli 缓冲液中相同的功能。

  分离胶中 pH 值为 8.8 的 tris 的原因是:

  在 pH 值 6.8 时,甘氨酸(来自运行缓冲液)接近其 6.08 的等电点,这意味着它仅在一小部分时间内带负电。正因为如此,它在浓缩胶中的蛋白质分析物后面移动。

  Cl –阴离子在 pH 值 6.8和8.8时均带负电荷。正因为如此,它们在浓缩胶中的蛋白质分析物前面移动。

  因此,在 pH 值为 6.8 的浓缩胶中,蛋白质被夹在后面的甘氨酸和前面的 Cl之间。

  但是当甘氨酸进入 pH 8.8 的分离凝胶时,它会完全去质子化,变成甘氨酸阴离子。

  太小而不受凝胶孔隙度的阻碍,甘氨酸盐会移动到蛋白质分析物的前面。因此,所有分析物一起沉积到分离凝胶中。这有利于获得最大的分析物分辨率。

  因此得名——浓缩胶。

  与此同时,甘氨酸和 Cl -飞向正极(阳极),留下相对大量的蛋白质分析物,以便通过聚丙烯酰胺凝胶基质。

  因此得名——分解凝胶。

  有关其余成分的结构,请查看图 1。它应该可以帮助您理解下面对它们的基本化学和功能的描述。

一个简单的 SDS-PAGE 凝胶配方和完美凝胶的 10 步流延协议

  图 1。SDS-PAGE 凝胶配方中关键化学品的结构。(图片来源:托马斯·沃里克。)

  1.丙烯酰胺

  为什么我们需要它?

  如前所述,我们将“丙烯酰胺”表示为丙烯酰胺和双丙烯酰胺的混合物。这些是凝胶的基本组成部分。

  它是如何工作的?

  丙烯酰胺含有易受自由基聚合影响的末端烯烃键。

  硫酸根自由基上的不成对电子攻击并破坏丙烯酰胺分子上烯烃的π键。这使得硫酸基团通过单键与丙烯酰胺分子的末端碳共价结合,并在相邻碳上形成不成对的电子。

  因此,由该反应产生的整个分子是自由基。

  然后,该自由基会破坏其他丙烯酰胺分子上的烯烃 π 键。其结果是越来越长的聚丙烯酰胺自由基。

  它们攻击更多的丙烯酰胺烯烃,依此类推,循环在称为“链式传播”的过程中重复。该反应如图 2 所示。

一个简单的 SDS-PAGE 凝胶配方和完美凝胶的 10 步流延协议

  图 2。在 SDS-PAGE 凝胶制备过程中丙烯酰胺/双丙烯酰胺自由基聚合过程中的链增长。(图片来源:托马斯·沃里克。)

  同时,双丙烯酰胺本质上是两个丙烯酰胺分子,通过两个酰胺 N 原子之间的亚甲基 (-CH 2 ) 桥连接在一起。正因为如此,两个烯烃键有效地指向外部,并且都容易发生自由基聚合。

  因此,双丙烯酰胺分子在新生的聚丙烯酰胺链之间形成交联。

  因此,丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例对于凝胶的孔隙率以及这两种试剂的浓度至关重要。

  安全须知

  丙烯酰胺是神经毒素!所以不要闻它,在你工作的时候把盖子放在瓶子上。更好的是,如果您可以轻松取用,请将其移到通风橱中。

  2. APS

  为什么我们需要它?

  过硫酸铵 (APS) 是引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的硫酸根自由基的来源。

  它是如何工作的?

  过硫酸铵是过硫酸根阴离子的铵盐。

  过硫酸根阴离子(本质上)是通过 O-O(过氧化物)键连接在一起的两个硫酸根阴离子。该键相对较弱,并且在 TEMED 存在下会断裂以产生硫酸根自由基。

  3. 泰梅德

  为什么我们需要它?

  N,N,N´,N´-四甲基乙二胺 (TEMED) 催化硫酸根自由基的产生。没有它,它们就不会形成。

  它是如何工作的?

  好的,TEMED 和 APS 之间的反应相当复杂,涉及到一个过渡态——哎呀!但简短的版本如下:

  TEMED 分子包含两个 N 原子,每个原子带有一对孤电子。这些孤对中的一对攻击过硫酸盐 O-O 键中的氧原子并将其破坏。

  该反应的产物是

  硫酸根阴离子;和

  TEMED 通过 N-O 键与另一个硫酸根阴离子结合。

  这种 N-O 键发生均裂,形成 TEMED 自由基和最重要的硫酸根自由基。

  如果您对详细机制感兴趣,请查看 Ziminska等人的这篇论文中的图 9 。[1]

  安全须知

  如果吸入或吞咽并具有腐蚀性(而且闻起来像鱼贩),TEMED 是有害的。工作时戴上丁腈手套并盖上瓶盖。

  4.异丙醇

  为什么我们需要它?

  它从未聚合的分离胶的弯液面上去除气泡,在分离胶和浓缩胶之间形成平坦的界面,并防止凝胶脱水。

  它是如何工作的?

  两种不混溶液体之间的最低能量界面具有尽可能小的表面积,即完全平坦的表面。

  只有当溶液的表面张力足够低时,才会形成气泡。在分离凝胶上加入异丙醇会增加其表面张力,使其超过可以形成气泡的点。

  分离凝胶中的水不能通过异丙醇层蒸发。

  当所有这些成分结合在一起并且凝胶发生聚合时,它就会呈现出图 3 所示的结构。

一个简单的 SDS-PAGE 凝胶配方和完美凝胶的 10 步流延协议

  图 3。SDS-PAGE 凝胶结构的快照。羧酰胺(来自丙烯酰胺)或双丙烯酰胺交联每两个碳原子发生一次。(图片来源:托马斯·沃里克。)

  凝胶铸造故障排除

  虽然浇铸 SDS-PAGE 凝胶非常常见,但仍有一些香蕉皮可供您使用。以下是一些常见的问题和一些避免它们的方法:

  如果我的凝胶没有凝固怎么办?

  准备新鲜的 10% APS 并重铸凝胶。由于 O-O 键较弱,过硫酸盐是不稳定的化合物,会随着时间的推移而断裂。

  发生这种情况时,您会失去引发丙烯酰胺聚合的自由基来源。

  这就是我们通常将 APS 储存在 –20 °C 的原因。

  10% APS 在 4°C 下可持续长达 3 个月,在 –20°C 下可持续长达 6 个月。

  确保将 10% APS 分成约 0.5 mL 的等分试样,以减少冷冻/解冻循环,这将加速其降解。

  如果我的凝胶的分辨率看起来不正确怎么办?

  我听到你问我不正确的分辨率是什么意思?

  我的意思是这样一种情况,您已经准备(例如)20% 的凝胶来分离 4-kDa 的蛋白质,但蛋白质在与较大的分析物分离之前已经从凝胶末端脱落。

  如果这是您,请准备新的 APS 并重铸。仔细检查您是否也分配了正确体积的 30% 丙烯酰胺。

  亲爱的,我缩小了我的凝胶

  准备新鲜的凝胶,并确保在潮湿的环境中用保鲜膜将它们牢固地密封。凝胶容易脱水,这会导致它们收缩。

  考马斯亮蓝染色后使用的脱色溶液中的化学物质也会导致凝胶收缩。

  如果你愿意,你可以在染色后有目的地收缩你的凝胶。把你的凝胶放在外面,整个东西最终会变小。这是一种安全便捷的凝胶储存方式。

  如何在凝胶凝固之前阻止凝胶泄漏?

  在玻璃夹层板的底部涂上一层封口膜以密封它们。您也可以在夹层板和铸造设备之间放置两块海绵而不是一块。

  你甚至可以拿两块海绵用封口膜包起来!

  如果这些提示失败,请养成倒一些凝胶的习惯,而不是你认为你需要的。

  轻松确认任何 SDS-PAGE 凝胶配方的分离能力

  要使用与此处提供的不同的 SDS-PAGE 凝胶配方吗?(我原谅你。)不确定你是否相信它告诉你添加多少丙烯酰胺?您可以通过计算轻松检查:

  (添加的丙烯酰胺体积 x 0.3)/制备的分离凝胶的总体积。

  例如,对于我们的 SDS-PAGE 凝胶配方表中的 10% 凝胶,它是:

  (5 毫升 x 0.3) / 15 毫升 = 0.1 = 10%


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