您的位置:首页>>公司动态>>行业资讯

慢病毒包装获得高滴度慢病毒方法(获得高滴度慢病毒的包装方法与流程)

发布时间:2022-04-06 10:23:20 阅读:13192次 来源:百度学术

  毒是强大的介导外源基因表达的工具,可在体内和体外实现过表达、基因沉默、基因编辑等多种应用,让我们的研究变得更加便利。然而对于刚接触包装慢病毒实验的新手来说包装出高滴度的慢病毒可能会比较复杂。本文则详细的讲解了通过慢病毒包装获得高滴度慢病毒的关键,希望对各位的实验有帮助。

慢病毒包装获得高滴度慢病毒方法(获得高滴度慢病毒的包装方法与流程)

  获得高滴度慢病毒的关键

  1.包装细胞

  细胞的健康状态是影响病毒产量的最关键因素。因此,我们一般我们选择293T细胞(稳定表达Large T antigen大T抗原版本)作为包装宿主。

  用于慢病毒包装的293T细胞的传代数不宜过高。当我们从ATCC或其他正规细胞库购得细胞后,将复苏并培养的那一代记为第1代(暂时不管之前ATCC到底传了多少代)。在扩增培养、冻存及后续复苏使用时,务必记录传代数。在我手里用于包装慢病毒的293T,通常都在第6代左右,到第15代包装出来滴度并未有显著下降,但并没有测试过更高的代数。

  第二是培养条件。293T细胞增殖飞快,营养消耗速率不低,因此保证培养基的养分充足也是个关键因素。通常使用高糖DMEM(含丙酮酸钠版本,多一些碳源)+10% FBS即可满足需求。但是,DMEM中的Glutamine并不稳定,在4℃保存和37℃水浴、培养的条件下会自发降解,因此推荐在上述培养基中添加GlutaMAX。

  2.转染

  高效率的转染也是保证高滴度的关键。不过在此有必要敲一下黑板:在考虑转染条件时,不光要看转染效率,还得看细胞毒性。事实上,293系列的细胞都极易转染,效率随随便便就破90%以上。因此,在包装慢病毒的转染实验中,我们应该更多地去关注毒性问题。正因如此,有不少方案甚至推荐使用钙磷转染法或PEI(聚乙烯亚胺)转染法。当然,在个人的经验中,并不需要做得如此极端。只要使用相对温和的试剂,并在转染后早些换液,即可避免毒性问题。

  3.Transfer Plasmid的大小

  这里我们定义,那个包含我们要表达的外源基因的质粒为transfer plasmid。大家应该已经清楚,transfer plasmid容纳外源基因长度的能力是有限的。尽管理论上,在LTR之间可以插入的基因长度约为8.5 kb,但超过3 kb就会导致包装效率降低。而整个质粒过大,也会导致转染效率降低,进而影响最后的滴度。插入片段的大小,是我们不能控制的,但我们可以尽量选择较小的transfer plasmid骨架(如无必要,不要携带其他元件如GFP等)。

图例

  4.Packaging Plasmid中的Tat

  包装慢病毒,除了transfer plasmid之外,我们还需要envelope plasmid和packaging plasmid。对于Envelope plasmid,通常我们选择VSV-G,因为含有这个包膜蛋白的慢病毒可以感染多种宿主。而packaging plasmid的基本构成为Gag,Pol,Rev和Tat。每一个组件的功能,可以在本文最后的附录表格中查到,但现在先来重点看一下Tat。

图例

  慢病毒是一种血源性病原体(要知道,人类免疫缺陷病毒,即HIV也是一类慢病毒)。为了将其改造成实验工具,科学家将慢病毒的包装和表达组件减少到最低程度。目前我们所能接触到的实验用慢病毒,由于至少需要3个质粒才能生产出来(即第二代慢病毒系统),因此成品慢病毒都不再具备生产子代病毒的能力。而为了进一步提高安全性,怕万一不小心真的见鬼了(即使几率低到不可思议),目前还有第三代慢病毒系统。它除了将packaging plasmid拆成几个之外,还对5’-LTR进行改造,从而进一步抛弃了Tat组件。

  然而,抛弃Tat组件是有代价的。即使采用了嵌合LTR的第三代transfer plasmid,一旦缺少了Tat,同样会导致滴度降低。具体请看这篇文章的数据(也就是创造第三代慢病毒的文章):其中pHR2是第二代质粒,在无Tat的情况下,滴度降低了一个数量级。而即使使用了第三代的pRRL质粒,缺少了Tat,滴度依然显著降低(虽然滴度近5 Million/ml,已经是非常高的了)。

图例

  因此,综合考虑安全性和滴度,我们可以采用分体的packaging plasmid,但额外加入表达Tat的质粒。

  5.病毒稳定性

  和其他生物制品一般,保证慢病毒的稳定性也是至关重要的因素。慢病毒是在37℃细胞培养环境中包装的。根据现有的认识,慢病毒在37℃溶液的半衰期不超过12小时,甚至有文献报道仅有6小时左右。由此可见,我们有必要从延长半衰期入手。

图例

  目前通常认为,常用的VSV-G包膜慢病毒对pH极为敏感。当pH低于7.0时,感染能力会逐步下降。尽管有另外的观点认为,pH 6.0反而有助于提高病毒滴度,但实际效果相当有限。再加上弱酸性环境,会给我们的细胞培养及后续使用病毒带来一些潜在的麻烦,因此这里依然建议将pH维持在7.2较为妥当。前面提到,293T是增殖极为迅速的细胞。这类细胞有一个共同的特点,即糖酵解代谢速率极高,会产生大量的乳酸,迅速酸化培养基(表观上看,培养基会很快变黄)。据此,我们可以额外加入10-15 mM HEPES增强DMEM培养基的pH缓冲能力。

  脂类和蛋白质是常用的生物制品稳定剂。下面这篇文献的结果显示,对纯化的慢病毒来说,加入脂蛋白和人血清白蛋白有助于延长半衰期。

  与此同时,Broad Institute的The RNAi Consortium的方案也显示,使用30% FBS或者额外添加终浓度1%的BSA,能够显著提高病毒滴度。从经济的角度而言,对于慢病毒粗制品,我们完全可以选择BSA方案,因为粗制品中已经含有携带脂类的FBS,我们只需提高整体蛋白浓度。

  尽管如此,慢病毒在37℃溶液的半衰期依然无法大幅度超过12小时。然而我们并不需要感到悲观,因这是一个生产和降解相互博弈的过程。只要包装生产的速度,远超过降解的速度,就可以保证获得高滴度的病毒。一般认为,在转染后的第24-48小时之间,是慢病毒的生产高峰。这时我们可以收获第一批慢病毒,此时也是滴度最高的时候。在随后的48-72小时中,包装依然持续进行,但滴度下降(生产能力下降,但降解速率不变)。从产量角度而言,在这24小时内,我们可以使用小体积的培养基收获1-2次慢病毒,并和第一次的合并。而如果单纯追求高滴度,收获一次即可。事实上,第一次收获的慢病毒,已经可以满足多次实验的需求了。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1024.html

注释:[本文仅供阅读]不代表企业及作者的立场,如侵权请联系删除,欢迎分享本文,转载请保留出处!

推荐服务

  • 分子实验

    分子实验平台为广大科研工作提供蛋白、RNA和DNA分子类分析及检测服务···

  • 细胞实验

    细胞实验平台为广大科研工作者提供原代细胞提取、鉴定和培养相关服务···

  • 病理实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供动物寄养、疾病模型构建和体内验证···

  • 动物实验

    动物实验平台为广大科研工作者提供科研成果向产品转化的服务,转化方···

  • 精准医疗

    精准医疗平台为癌症患者提供肿瘤移植动物体内服务,模拟患者癌症发展···