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真核细胞蛋白表达与纯化步骤(如何使用真核系统进行蛋白质表达和纯化)

发布时间:2022-03-13 10:34:38 阅读:17342次 来源:百度学术

  使用细菌细胞是蛋白质表达和纯化的常用方法。然而,细菌表达系统缺乏真核蛋白质所需的适当折叠和翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化等)。那么,如果您需要真核蛋白的准确表达和纯化,您应该怎么做?看看最有效的基于真核的蛋白质表达系统之一:昆虫细胞系和重组杆状病毒。

  昆虫细胞系 101:基础知识

  首次开始使用基于真核的蛋白质表达系统时,为您的实验需求选择合适的细胞系非常重要。用于蛋白质表达和杆状病毒生成的最广泛可用和最佳优化的昆虫细胞系是 Sf9 和 Sf21 ( Spodoptera frugiperda ) 和 High Five TM  ( Trichoplusia ni )。一般来说,昆虫细胞系可以在与许多其他细胞类型大致相同的条件下培养。这包括在有或没有血清的培养基中培养,以及在培养基中添加抗生素/抗真菌剂以避免污染。然而,与需要 CO 2的哺乳动物细胞系不同, 孵化器,所有昆虫细胞需要的是一个普通的 28°C 孵化器。这是因为昆虫细胞培养基含有磷酸盐,而不是碳酸盐(存在于哺乳动物细胞培养基中)。

  在培养昆虫细胞系时,重要的是要考虑它们在实验室和需要细胞的实验中使用的频率。事实上,如果实验室不需要大量昆虫细胞,我建议在 10 cm 平板上以 2×10 6 密度培养,每 3-4 天分裂一次,只要它们达到 75% 融合。昆虫细胞系粘附松散,因此不需要胰蛋白酶消化。如果您的工作需要更多细胞,在 150 mL 锥形瓶中培养 30 mL 将是更好的选择。悬浮培养物也可用于以更高的体积放大蛋白质表达。为了制作昆虫细胞系的冷冻 原液,在含有 15% DMSO 和 20% BSA 的 SFM中以大约 2×10 7的密度冷冻细胞。

  让他们表达你的蛋白质!

  第 1 部分:产生重组杆状病毒

  一旦您的昆虫细胞培养物满意并不断生长,就该开始关注蛋白质表达了。在昆虫细胞系中表达蛋白质的一种方法是通过产生重组杆状病毒(图 1)。杆状病毒最常用的工作流程称为 Bac-to-Bac TM  (1)。将感兴趣的基因 (GOI) 成功克隆到 pFastBac 载体(供体质粒)后,使用 pFastBac + GOI 载体转化 大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞。DH10Bac 细胞含有穿梭载体(杆粒)和辅助质粒;辅助质粒包含转座酶,它有助于将 GOI 转座到杆粒中,从而产生重组杆粒。在这个阶段使用蓝白筛选来鉴定重组构建体。然后使用 PureLink TM  HiPure Mini-prep 试剂盒从转化的 大肠杆菌中 分离重组杆粒 DNA。重组杆粒的大小很大,因此常规的小量制备试剂盒可能不适用于重组杆粒的分离。然后将重组杆粒的纯化 DNA 用于感染培养的昆虫细胞系。

  第 2 部分:用杆状病毒感染昆虫细胞系

  第一轮感染是在小规模(6 孔板或 30 mm 板)中进行的,含有 1 µg DNA。密切注意细胞:当受感染的细胞变大并开始从培养皿表面脱落时,可以发现阳性病毒感染。从该阶段 (P0) 收集的病毒用于感染大量细胞 (10 cm 板), 这称为 P1 阶段 (图 1)。然后可以将 P1 病毒用于更大的悬浮培养 (30 mL) 以生成 P2 阶段病毒 (图 1)。在 P2 阶段,可以纯化蛋白质或将其放大至更高体积的细胞(P3 阶段)。我建议在每个阶段收集病毒并将其储存在-80°C,以便在需要蛋白质时用于感染,从而无需再次经历整个工作流程,从而节省时间。所以,

图1

  瞬时蛋白表达

  杆状病毒是高水平表达重组蛋白的最有效方法之一,但操作繁琐且耗时。如果您的目的蛋白不需要重复出现,另一种方法是在昆虫细胞系中瞬时表达。在昆虫细胞系中瞬时表达的过程类似于 在哺乳动物细胞系中 基于脂质体的转染。通常用于瞬时表达的载体是 pBiex。与杆状病毒类似,瞬时表达也会导致高蛋白表达水平。细胞应以 2×10 6转染 密度,可在 72 小时后收获用于裂解和蛋白质纯化。Cellfectin 和 Escort VI 等转染试剂可用于昆虫细胞系的瞬时或稳定表达。

  离别词

  最后,一个小建议:包括一个荧光标签以及您感兴趣的蛋白质和纯化标签。无论您是在 pFastBac 还是 pBiex 中进行克隆,荧光标签之后都可以让您使用荧光显微镜直观地监测蛋白质的表达水平。

  总之,昆虫细胞系是在真核宿主中表达和纯化蛋白质的绝佳选择。根据您的需要和实验,它们可用于稳定或瞬时表达,从而提供灵活性。只要好好照顾它们,它们就会产生大量的蛋白质!

  参考文献:

  1.Jarvis,DL 杆状病毒-昆虫细胞表达系统。酶学方法 463,(Elsevier Inc.,2009)。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/932.html

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