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细胞实验外包:传代细胞培养的方法(原代细胞培养步骤及注意事项)

发布时间:2021-11-22 10:09:51 阅读:113282次 来源:百度学术

  传代细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

  材料和试剂

  1. 细胞:贴壁细胞株

  2. 试剂:0.25%胰酶、1640 培养基(含 10%小牛血清或胎牛血清)

  3. 仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

  操作步骤

  1. 吸除培养瓶内旧培养液。

  2. 向瓶内加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液少许,以能覆满瓶底为限。

  3. 置温箱中 2~5 分钟,当发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,立即终止消化。

  4. 吸除消化液,向瓶内注入 Hanks 液数毫升,轻轻转动培养瓶,把残余消化液冲掉。注意加 Hanks 液冲洗细胞时,动作要轻,以免把已松动的细胞冲掉流失,如用胰蛋白酶液单独消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用 Hanks 液冲洗,直接加入培养液。

  5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

  6. 计数板计数后,把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中,置温箱中培养。

  无菌操作注意事项

  1. 操作前要洗手,进入超净台后手要用 75%酒精或 0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

  2. 点燃酒精灯,操作在火焰附近进行,耐热物品要经常在火焰上烧灼,金属器械烧灼时间不能太长,以免退火,并冷却后才能夹取组织,吸取过营养液的用具不能再烧灼,以免烧焦形成碳膜。

  3. 操作动作要准确敏捷,但又不能太快,以防空气流动,增加污染机会。

  4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分,工作台面上用品要布局合理。

  5. 瓶子开口后要尽量保持 45℃斜位。

  6. 吸溶液的吸管等不能混用。

  原代细胞培养

  原代细胞培养将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用 EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。

  仪器、材料及试剂

  仪器:培养箱(调整至 37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)

  材料:动物组织块

  试剂:1640 培养基(含 20%小牛血清或胎牛血清),0.25%胰酶,Hank′s 液,碘酒

原代细胞培养

  初代消化培养法

  1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒 20 分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

  2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。

  3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用 Hanks 液漂洗 2~3 次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中 30~60 分钟。

  4. 剪切:用眼科剪把组织切成 2~3 毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。

  5. 消化:或用恒温水浴,或置于 37℃温箱消化均可,消化中每隔 20 分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

  6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000 转/分)离心消化液 5 分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。

  7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH 要求在 7.2~7.4 范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3 调整。

  8. 培养:置于 36.5℃温箱培养,如用 CO2 温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。

  初代组织块培养法

  1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用 Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静 Hanks 液,用眼科剪反复剪切 1mm3 块为止。

  2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以 0.5cm 为宜,每一 25ml 培养瓶底可摆布 20~30 块。

  3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置 36.5℃温箱培养 2 小时左右(勿超过 4 小时),使小块微干涸。

  4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46 度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

  原代细胞培养错误方法

  长时间水浴解冻

  因为原代细胞非常容易受到解冻过程的影响,所以在37℃水浴锅中解冻时,要在水中摆动溶解。在细胞半溶后(不要等到全部溶解),迅速拿到生物安全柜或超净台中,用1ml的枪,抽出事先准备好的完全培养基打入冻存管中,然后抽到培养瓶中,反复进行,直至完全溶解。

  把冻存管的细胞溶解后迅速离心

  如果原代细胞溶解后马上离心,细胞所受的打击可能比DMSO的毒性还要大,不建议采用这个方法。用带有血清的完全培养基溶解后铺瓶,第二天换液去除DMSO。

  让原代细胞长满(100%)瓶(皿、板)

  原代细胞长满后,细胞会出现老化。因为原代细胞不是100%的细胞团,把混入的细胞控制在最小限度非常重要。建议细胞长到90-95%进行传代。

  传代时用大量的胰蛋白酶处理

  原代细胞传代时,要用低浓度的胰蛋白酶消化,在显微镜下看到细胞开始变圆、脱落后迅速终止胰蛋白酶。建议采用含10%血清的完全培养基终止或大豆由来的蛋白酶终止剂终止。

  细胞培养后再冻存

  原代细胞再冻存后,细胞会老化、也可能引起机能变化,所以不建议再冻存。细胞再冻存也是细胞死伤的主要原因。

  原代细胞无限增殖

  原代细胞和细胞系不同,增殖能力是有限的。为了防止遗传上的变化,最好尽快开始做实验。另外,为了防止混入杂细胞比例的增加,要经常观察细胞形态。

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