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细胞实验:细胞模型构建点突变细胞模型

发布时间:2021-09-18 02:32:01 阅读:15022次 来源:本站

  全球有超过50000种人类相关的遗传疾病,其中大部分是由基因组的点突变引起的。而对于罕见病而言,80%是由基因缺陷引起的,同时这些基因缺陷中点突变又占了60%。比如,我们熟悉的镰刀型红细胞贫血症就是由于β-globin基因编码区上的一个碱基位点发生突变引起的;又比如多发性神经纤维瘤(Neurofibromatosis)则是由 Neurofibromin 1/2基因发生碱基突变引起的。由此可以看出,对基因组点突变的研究不仅能揭示一些重要的生物学原理,更有利于人类疾病治疗手段的研发。

  什么是点突变

  点突变是基因突变的一种,广义的点突变包括所有单个碱基的改变,即缺失、插入和替换。而狭义的点突变主要指单个碱基的替换。嘌呤之间和嘧啶之间的替换叫做转换,而嘧啶与嘌呤之间的替换则叫颠换。以上说的都是DNA分子层面的改变,如果把视角扩展到染色体的层面,则存在染色体数量改变和染色体结构变异两种。

点突变细胞模型

 点突变的方式

  点突变对氨基酸及其构成的蛋白质结构和功能的影响分为三种,即同义突变、无义突变和错义突变。一般情况下,在相同的位点,无义突变对蛋白质影响最大,错义突变的非保守型突变次之,接下来是错义突变中的保守型突变,同义突变本身对蛋白质功能无影响。

点突变细胞模型

  点突变对氨基酸的影响

  点突变疾病模型的构建

  研究点突变相关遗传疾病,免不了要构建细胞模型和动物模型,而我们在构建细胞点突变模型时的理论基础便是基因的同源重组修复。当细胞基因组DNA双链由于外部因素而断裂时,细胞中存在着一种DNA修复机制就会被激发,对断裂位点的DNA双链进行修复,根据修复方式的不同可分为同源重组修复和非同源重组修复。顾名思义,同源重组是指DNA在修复的过程中以同源的DNA序列作为模板完美修复,而非同源重组修复是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来,同时可能会随机引入新的碱基。

点突变细胞模型

  DNA双链断裂修复途径。A)同源重组修复,B)非同源重组修复。

  根据这个理论基础,点突变细胞系的构建分为三个部分:

  1. 定点切割DNA

  由于在自然界中DNA的断裂是随机的,不确定的,因此我们需要人为的定点对DNA产生切割。在这个过程中,CRISPR-Cas9技术给我们提供了极大的便利。我们可以通过人为的设计sgRNA,并将Cas9蛋白与sgRNA一起转染到目的细胞中。在sgRNA的引导下,Cas9蛋白对靶位点处的DNA进行切割,产生DNA双链断裂。

  2. 同源重组修复DNA

  我们通过CRISPR-Cas9技术对细胞内的基因组DNA产生了双链断裂后,同时引发了细胞内的DNA修复机制。因此,为了使DNA在修复过程中能通过同源重组的方式修复DNA并引入突变位点,我们需要为细胞提供额外的同源修复模板。这个模板的本质是人为合成的DNA序列,由5’端同源臂、突变位点和3’端同源臂组成。值得注意的是,这种同源模板序列是随sgRNA和Cas9蛋白一起转染进细胞的。

  3. 阳性细胞筛选

  这部分是细胞模型构建的关键部分。试想下,我们通过细胞转染技术将CRISPR-Cas9系统和模板DNA序列转入细胞中后,由于细胞内部机制的作用,我们得到的细胞池中既包含纯合子阳性细胞和杂合子细胞,又包含没有发生碱基突变的野生型细胞。那么,我们该如何挑选出目的细胞将是关键。对于点突变模型来说,由于没有引入抗性基因,常用的方法便是通过稀释法将细胞池细胞稀释转移到96孔板中,形成单克隆细胞。然后收集单克隆细胞进行大量测序,以得到预期的纯合子细胞。

  由于人类疾病中基因产物并非总是如转基因一样的高表达,也不是像基因敲除一样完全不表达。很多情况下只是由于单个或者少数几个碱基的改变而造成的蛋白结构改变,表现为非正常激活或者抑制。因此,构建精细的与疾病对应的点突变模型便成为了疾病临床前研究的最佳方案。而现在的CRISPR-Cas9技术也使得我们能够以更低的成本和功能高的效率将之实现。

  参考文献:

  1. Wu WH, Tsai YT, Justus S, Cho GY, Sengillo JD, Xu Y, Cabral T, Lin CS, Bassuk AG, Mahajan VB, Tsang SH. CRISPR Repair Reveals Causative Mutation in a Preclinical Model of Retinitis Pigmentosa: A Brief Methodology. Methods Mol Biol. 2018;1715:191-205. doi: 10.1007/978-1-4939-7522-8_13. PMID: 29188514.

  2. Peng G, Lin SY. Exploiting the homologous recombination DNA repair network for targeted cancer therapy. World J Clin Oncol. 2011 Feb 10;2(2):73-9. doi: 10.5306/wjco.v2.i2.73. PMID: 21603316; PMCID: PMC3095467.

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/340.html

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