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流式细胞术如何固定和通透细胞(流式细胞固定方法)

2022-03-04 10:39:42
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  进行流式细胞术,如果你所有的靶标均在外表面表达,那么可使用活细胞。但当你靶向胞内蛋白时,需依次进行固定、通透细胞并用抗体和/或偶联抗体对细胞进行免疫染色。

  固定会交联细胞中的大分子并将靶蛋白锁定到位。通透化使抗体能够进入胞内间隙。关于固定、通透化的实验步骤,有一些注意事项。

  在www.cellsignal.cn 上可找到每种经流式细胞术验证的抗体的建议固定和通透化实验步骤。只需在搜索栏中输入产品货号便会看到产品页。

  固定前,你的细胞需放在单细胞悬浮液中以确保读数和分析准确。如果你的原始材料是黏附细胞或组织,那么你需要用胰蛋白酶或其他蛋白酶彻底分离细胞。一旦你获得单细胞悬浮液,便可用各流式细胞术试管继续进行固定、通透化和染色步骤,或者可以对大批量细胞进行固定和通透化,并将它们分装,用于后续分析。

  对于许多抗体,建议的固定剂包括甲醛,也就是多聚甲醛的含水单体形态。在通透化前固定细胞有助于尽量减少靶蛋白的丢失并保留信号转导状态。这一点在诸如使用磷酸化特异性抗体来对信号转导活动进行表征鉴定时尤为重要。

  固定后,确保彻底洗掉固定剂。这可避免细胞内的蛋白过度交联,并消除抗体通过残余固定剂与非特异性靶标交联的风险。固定并清洗细胞后,便可以进行通透化。

  一些抗体需使用某种特定的通透化试剂,而另一些则在使用多种试剂时效果相当。你可以在cellsignal.cn 抗体产品页上找到适合你的抗体的建议通透化试剂。CST经流式细胞术验证、针对胞内靶标的抗体大部分都适合甲醇通透化。甲醇等溶剂可更容易地进入细胞核、线粒体和溶酶体等细胞器的内部。在某些情况下,甲醇会影响表位结构。这会对检测产生积极或消极影响,具体取决于抗体和表位。皂素等去垢剂能更好地保留表位的天然结构,但可能无法更容易地进入。

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