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DNA 测序-Maxam-Gilbert 和 Sanger 双脱氧法

发布时间:2022-01-29 10:38:40 阅读:17742次 来源:百度学术

  DNA测序是指确定DNA分子中核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的顺序的方法。

  第一个 DNA 序列是由学术研究人员在 1970 年代早期使用基于二维色谱的实验室方法获得的。

  随着基于染料的自动分析测序方法的发展,DNA测序变得更容易和更快。

DNA测序

  众所周知,有两种主要的方法可用于对 DNA 进行测序:

  化学方法(在其发明者之后也称为 Maxam-Gilbert 方法)。

  链终止法(在其发明者之后也称为桑格双脱氧法)。

  Maxam-Gilbert 技术依赖于不同核苷酸键的相对化学性质,而 Sanger 方法通过将双脱氧核苷酸掺入序列中来中断 DNA 序列的延伸。

  链终止方法是更常用的方法,因为它速度快且简单。

  化学裂解法(Maxam-Gilbert 法)

  1976-1977 年,Allan Maxam 和 Walter Gilbert 开发了一种基于 DNA 化学修饰和随后在特定碱基处切割的 DNA 测序方法。

  该方法需要在一端进行放射性标记并纯化要测序的 DNA 片段。

  基于四种反应(G、A+G、C、C+T)中的每一种,化学处理在四种核苷酸中的一种或两种的小比例处产生断裂。

  因此,从放射性标记的末端到每个分子中的第一个“切割”位点,产生了一系列标记的片段。

  四个反应中的片段在凝胶电泳中并排排列以进行大小分离。

  为了使片段可视化,将凝胶暴露在 X 射线胶片上进行放射自显影,产生一系列暗带,每个暗带对应于放射性标记的 DNA 片段,从中可以推断出序列。

  主要特点

  某些化学物质对 DNA 的碱基特异性切割

  四种不同的化学品,每个碱基一种

  一组不同大小的 DNA 片段

  DNA 片段包含多达 500 个核苷酸

  好处

  纯化后的 DNA 可直接读取

  同源 DNA 序列的测序效率与异质 DNA 序列一样有效

  可用于分析 DNA 蛋白质相互作用(即足迹)

  可用于分析核酸结构和对 DNA 的表观遗传修饰

  缺点

  它需要大量使用危险化学品。

  它具有相对复杂的设置/技术复杂性。

  它很难“放大”,不能用于分析超过 500 个碱基对。

  不完全的切割反应导致读取长度减少。

  很难制作基于 Maxam-Gilbert 测序的 DNA 试剂盒。

  链终止法(Sanger 双脱氧法)

链终止法(Sanger 双脱氧法)

  与 Maxam 和 Gilbert 的方法相比,链终止剂方法更有效,使用的有毒化学品和放射性更少。

  Sanger 方法的关键原理是使用双脱氧核苷酸三磷酸 (ddNTPs) 作为 DNA 链终止剂。

  链终止方法需要单链 DNA 模板、DNA 引物、DNA 聚合酶、放射性或荧光标记的核苷酸以及终止 DNA 链延伸的修饰核苷酸。

  DNA 样品分为四个独立的测序反应,包含所有四种标准脱氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)和 DNA 聚合酶。

  向每个反应中仅添加四种双脱氧核苷酸(ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP)中的一种,它们是链终止核苷酸,缺少在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键所需的 3'-OH 基团,从而终止 DNA 链延伸并产生不同长度的DNA片段。

  新合成和标记的 DNA 片段经过热变性,并通过变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶上的凝胶电泳按大小分离,四个反应中的每一个都在四个单独的泳道之一(泳道 A、T、G、C)中进行。

  然后通过放射自显影或紫外光显示 DNA 条带,并且可以直接从 X 射线胶片或凝胶图像上读取 DNA 序列。

  泳道中的深色条带表示 DNA 片段,该片段是在掺入双脱氧核苷酸(ddATP、ddGTP、ddCTP 或 ddTTP)后链终止的结果。

  然后使用四个泳道中不同条带的相对位置(从下到上)读取 DNA 序列。

  链终止测序的技术变化包括用含有放射性磷的核苷酸进行标记,或使用在 5' 端用荧光染料标记的引物。

  染料引物测序有助于在光学系统中读取,从而实现更快、更经济的分析和自动化。

桑格双脱氧法

  主要特点

  使用双脱氧核苷酸终止 DNA 合成。

  四个独立试管中的 DNA 合成反应

  放射性 dATP 也包含在所有试管中,因此 DNA 产物将具有放射性。

  产生一系列 DNA 片段,其大小可以通过电泳测量。

  每个片段中的最后一个碱基是已知的。

  优势

  链终止方法大大简化了 DNA 测序。

  限制

  引物与 DNA 的非特异性结合,影响 DNA 序列的准确读出。

  影响序列保真度的 DNA 二级结构。

  DNA测序的意义

  通过 DNA 测序获得的信息使得了解或改变基因的功能成为可能。

  DNA 序列分析显示了控制基因表达的调控区域和特别易受突变影响的遗传“热点”。

  DNA序列的比较显示了进化关系,为包括病毒在内的微生物的明确分类提供了框架。

  DNA 序列的比较有助于识别保守区域,这有助于开发特异性杂交探针以检测临床样品中的微生物,包括病毒。

  DNA 测序已经变得足够快速和便宜,以允许实验室确定微生物序列以鉴定微生物。16S 核糖体亚基的测序可用于识别特定的细菌。病毒测序可用于识别病毒和区分不同的毒株。

  DNA测序显示基因结构,帮助研究人员找出基因产物的结构。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/772.html

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