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脉冲场凝胶电泳PFGE(脉冲场凝胶电泳 原理及主要步骤)

发布时间:2022-01-27 10:20:53 阅读:124362次 来源:百度学术

  脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 是一种用于分离大型脱氧核糖核酸 (DNA)分子的技术,方法是向凝胶基质施加周期性改变方向的电场。

  由于迁移通过凝胶的大于 15-20kb 的 DNA 基本上以与大小无关的方式一起移动,标准凝胶电泳技术无法有效分离非常大的 DNA 分子,这导致了脉冲场凝胶电泳的实践。

  1982 年,Schwartz 提出了利用两个交变电场可以分离大于 50 kb 的 DNA 分子的概念。

脉冲场凝胶电泳 (PFGE)

  脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 原理

  虽然通常小片段比大 DNA 片段更容易通过凝胶基质,但阈值长度存在于 30-50 kb 以上,所有大片段将以相同的速率运行,并在凝胶中显示为单个大扩散乐队。

  然而,随着场方向的周期性变化,不同长度的 DNA 以不同的速率对变化作出反应。也就是说,当电场方向改变时,较大的 DNA 片段重新排列电荷的速度会更慢,而较小的片段会更快。随着方向的不断变化,随着时间的推移,即使在非常大的长度上,每个带也将开始越来越多地分开。因此,使用 PFGE 分离非常大的 DNA 片段成为可能。

  脉冲场凝胶电泳法(PFGE)

脉冲场凝胶电泳法(PFGE)

  该技术的过程与进行标准凝胶电泳比较相似,只是不是在一个方向上不断地运行电压,而是在三个方向之间周期性地切换电压;一个穿过凝胶的中心轴,两个在两侧以 60 度角延伸。

  每个方向的脉冲时间相等,导致 DNA 向前净迁移。

  脉冲场凝胶电泳的主要步骤是:

  裂解:首先,将细菌悬浮液加载到琼脂糖悬浮液中。这样做是为了通过将染色体 DNA 固定在琼脂糖块中来保护染色体 DNA 免受机械损伤。然后裂解细菌细胞以释放 DNA。琼脂糖-DNA 悬浮液也称为塞模。

  DNA 的消化:细菌 DNA 用不寻常的切割限制性内切酶处理,从而产生较少数量的较大 DNA 片段(与 RFLP 中使用的经常使用的限制性内切酶产生大量较小片段相反)。

  电泳:通过施加电流并定期改变其方向,对较大的 DNA 片段进行脉冲场凝胶电泳(与传统的琼脂糖凝胶电泳不同,在单个方向上施加电流以分离较小片段) .

  分析: PFGE 生成的不同生物体的片段手动或通过 BioNumerics 等计算机软件与标准进行比较。

  脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 的应用

  由于现场凝胶电泳允许分离包含高达 100,000 bp(100 千碱基对或 kbp)的 DNA 片段,因此对此类大片段的表征允许构建来自几种细菌物种的染色体的物理图谱。

  PFGE 可用于基因分型或基因指纹识别。

  它通常被认为是病原微生物流行病学研究的金标准。

  亚型使区分单核细胞增生李斯特菌菌株变得更容易,从而将环境或食品分离物与临床感染联系起来。

  脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 的优势

  PFGE 将 DNA 从几 kb 到超过 10 Mb 对分开。

  PFGE分型已成功应用于多种病原菌的分型,与流行病学相关性高度一致。

  PFGE 已被反复证明比对许多细菌的核糖分型或多位点序列分型等方法更具辨别力。

  相同基本格式的 PFGE 可用作细菌亚型的通用通用方法。(只有限制酶的选择和电泳条件需要针对每个物种进行优化。)

  PFGE 产生的 DNA 限制模式稳定且可重复。

  脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 的局限性

  耗时。

  需要训练有素的熟练技术人员。

  不区分所有不相关的分离物。

  技术人员之间的模式结果略有不同。

  不能同时优化凝胶各个部分的分离。

  真的不知道相同大小的条带是否是相同的 DNA 片段。

  乐队不是独立的。

  一个限制位点的变化可能意味着不止一个带的变化。

  “相关性”应该用作指导,而不是真正的系统发育测量。

  PFGE 无法对某些菌株进行分型。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/768.html

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