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PCR的类型有哪些及应用范围(聚合酶链式反应)

发布时间:2022-01-18 09:58:05 阅读:17492次 来源:百度学术

  PCR是众所周知的分子生物学技术之一。20世纪70年代,研究人员首次报道了使用合成引物和DNA聚合酶从模板复制单链DNA。然而直到1983年,Kary Mullis才发明出用于扩增目标DNA的研究工具,就是我们今天所熟知的PCR方法。从此以后,PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分,被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。

  PCR 类型列表

  扩增片段长度多态性 (AFLP) PCR

  等位基因特异性PCR

  铝聚合酶链反应

  组装PCR

  不对称PCR

  冷PCR

  菌落PCR

  常规 PCR

  数字 PCR (dPCR)

  快速循环 PCR

  高保真 PCR

  高分辨率熔解 (HRM) PCR

  热启动 PCR

  原位 PCR

  序列间特异性 (ISSR) PCR

  反向PCR

  LATE(指数后线性)PCR

  连接介导的 PCR

  长程PCR

  甲基化特异性 PCR (MSP)

  微引物 PCR

  多重PCR

  纳米粒子辅助 PCR (nanoPCR)

  嵌套 PCR

  重叠延伸 PCR

  实时 PCR(定量 PCR 或 qPCR)

  基于重复序列的 PCR

  逆转录酶 (RT-PCR)

  逆转录酶实时 PCR (RT-qPCR)

  RNase H 依赖性 PCR (rhPCR)

  单细胞PCR

  单特异性引物-PCR (SSP-PCR)

  固相PCR

  自杀聚合酶链反应

  热不对称交错 PCR (TAIL-PCR)

  着陆 (TD) PCR

  可变数量串联重复 (VNTR) PCR

pcr类型列表

  1. 扩增片段长度多态性 (AFLP) PCR

  这是一种基于PCR的技术,它使用选择性扩增一段消化的 DNA 片段来为感兴趣的基因组生成独特的指纹。

  这种技术可以为任何生物快速生成大量标记片段,而无需事先了解基因组序列。

  AFLP PCR 使用限制性内切酶消化基因组 DNA,并允许将接头连接到片段的粘性末端。

  然后通过使用与接头序列互补的引物选择一部分限制性片段进行扩增。

  扩增的序列在琼脂糖凝胶电泳变性时被分离和可视化。

  AFLP PCR 可用于多种应用,如评估物种内或密切相关物种之间的遗传多样性、推断种群水平的系统发育和生物地理模式、生成遗传图谱和确定栽培品种之间的相关性。

  2. 等位基因特异性 PCR

  等位基因特异性聚合酶链反应(AS-PCR)是一种基于等位基因特异性引物的技术,可用于分析单核苷酸多态性。

  等位基因特异性PCR 也称为(扩增难治突变系统)ARMS-PCR,对应于对两个不同等位基因使用两种不同的引物。

  一种是对正常PCR反应无效(抗性)的突变引物组,另一种是对突变PCR反应无效的正常引物组。

  这些引物的 3' 末端经过修饰,使得一组引物可以扩增正常等位基因,而其他引物可以扩增突变等位基因。

  这种错配允许引物扩增单个等位基因。

  广泛应用于镰状细胞性贫血、地中海贫血等单基因点突变检测。

  它还用于直接测定 ABO 血型基因型。

  3. 铝 PCR

  Alu PCR 是一种快速简便的 DNA 指纹识别技术,它基于同时分析被 Alu 重复元件包围的许多基因组位点。

  Alu 元件是 DNA 的短片段,最初以黄节杆菌 (Alu) 限制性核酸内切酶的作用为特征。

  Alu 元素是最丰富的转座因子之一,存在于整个人类基因组中,它们在进化中发挥作用并已被用作遗传标记

  在 Alu PCR 中,使用与这些序列互补的两种荧光染料标记的引物进行 PCR,然后通过以下方法分析 PCR 产物

  Alu 插入已用于几种遗传性人类疾病和各种形式的癌症。因此,这种 PCR 在检测这些疾病和突变中起着至关重要的作用。

  4. 组装 PCR

  组装 PCR 是一种从多个较短片段组装大 DNA 寡核苷酸的方法。

  在 PCR 中,使用的寡核苷酸大小为 18 个碱基对,而在组装中,PCR 长度高达 50bp 以确保正确杂交。

  在 PCR 循环期间,寡核苷酸与互补片段结合,然后被聚合酶填充。

  因此,该 PCR 的每个循环都会随机增加各种片段的长度,具体取决于哪些寡核苷酸彼此发现。

  组装 PCR 用于提高所需蛋白质的产量,也可用于产生大量 RNA 用于结构或生化研究。

  5. 不对称 PCR

  不对称 PCR 是 PCR 的一种变体,用于优先扩增原始 DNA 的一条链而不是另一条链。

  不对称 PCR 与常规 PCR 的不同之处在于所选链的引物数量过多。

  随着不对称 PCR 的进行,低浓度限制引物定量地掺入新合成的双链 DNA 中并用完。

  因此,在耗尽限制性引物后,从过量引物中线性合成目标单 DNA 链。

  当只需要扩增两条互补链中的一条时,例如在测序和杂交探测中,它很有用。

  6. 冷 PCR

  基于较低变性温度的聚合酶链式反应 (COLD-PCR) 的共扩增是一种新型 PCR 形式,可选择性地从野生型和含有突变体(或含有变体)的序列的混合物中扩增低丰度 DNA 变体,无论突变类型或扩增子上的位置。

  该方法基于对含有突变的 DNA 优先于野生型熔化的临界温度的修改。

  变性后有一个中间退火过程,允许野生型和突变等位基因杂交。这种错配稍微改变了 ds DNA 的解链温度。

  这些异源双链会融化并用作模板。结果,更大比例的次要变异 DNA 将被扩增,并可用于后续的 PCR 轮次。

  PCR 在检测肿瘤标本中的突变方面发挥着至关重要的作用,尤其是在异质肿瘤和体液中。

  这种 PCR 还有助于评估手术或化疗后的残留疾病以及疾病分期和分子谱分析,以预测预后或为个体患者定制治疗。

  7. 菌落 PCR

  菌落 PCR 是一种方法,其中通过设计插入的 DNA 特异性引物来识别插入质粒中的目的 DNA。

  含有质粒的菌落可以使用两组引物直接扩增。

  第一组是扩增插入序列的插入特异性引物,另一组是扩增插入DNA以外的质粒DNA的载体特异性侧翼引物。

  取一个细菌菌落并直接添加到包含所有其他 PCR 试剂的主混合物中。

  菌落 PCR 的主要应用是识别插入的 DNA 正确连接和插入细菌以及酵母质粒。

  8. 常规 PCR

  聚合酶链式反应 (PCR) 是一种用于 DNA 复制的试管系统,它允许“目标”DNA 序列在短短几个小时内选择性地扩增数百万倍。

  PCR 能够使用参与细胞遗传物质复制的 DNA 聚合酶合成特定的 DNA 片段。

  这种酶合成 DNA 的互补序列,因为一个小片段(引物)连接到选择开始合成的特定位点的 DNA 链之一。

  引物限制了要复制的序列,其结果是扩增了具有数十亿份拷贝的特定 DNA 序列。

  常规 PCR 应用于选择性 DNA 分离、DNA 扩增和定量、医学和诊断方法、传染病诊断、法医研究和研究领域。

  9. 数字 PCR (dPCR)

  数字 PCR (dPCR) 是一种定量 PCR 技术,它为测量样品中存在的 DNA 或 RNA 的量提供了一种灵敏而有效的方法。

  对于 dPCR,初始样品混合物在扩增步骤之前被分成大量单独的孔,从而导致每个孔中存在或不存在目标序列。

  根据扩增反应孔中荧光的存在或不存在,计算原始样品中存在的靶标的绝对数量。

  有荧光信号的孔被认为是阳性的,记为“1”,而没有这种信号的孔是阴性的,记为“0”。

  然后通过泊松统计分析确定初始样品中存在的目标序列的浓度。

  dPCR 用于确定各种临床样本中 DNA 和 RNA 病毒、细菌和寄生虫的总数,主要是在没有经过良好校准的标准时。

  10. 快速循环 PCR

  快速循环 PCR 是一种基于 PCR 的技术,可以在显着缩短循环时间的情况下扩增特定的 PCR 产物。

  这个过程的原理与传统的PCR相同,唯一的区别是扩增的时间。

  此 PCR 中使用的缓冲液增加了 Taq DNA 聚合酶对短单链 DNA 片段的亲和力,将成功引物退火所需的时间缩短至仅 5 秒。

  快速循环 PCR 对于需要快速循环的过程至关重要,也有助于快速诊断疾病和突变。

  11. 高保真 PCR

  高保真 PCR 是一种改良的 PCR 方法,它利用具有低错误率的 DNA 聚合酶,并在目标 DNA 的复制中产生高度的准确性。

  此类酶在扩增过程中对正确的三磷酸核苷具有显着的结合亲和力。

  在聚合酶活性位点结合不正确的情况下,由于活性位点复合物的结构,掺入速度会减慢。

  高保真扩增对于结果取决于正确的 DNA 序列(如克隆、SNP 分析、NGS 应用)的实验至关重要。

  12. 高分辨率熔体 (HRM) PCR

  它是一种非常强大的技术,用于检测双链 DNA

  样本中的突变、多态性和表观遗传差异。

  与测序和 Taqman SNP 分型等其他基因分型技术相比,它具有巨大的成本效益。这使其成为大规模基因分型项目的理想选择。

  它快速而强大,因此能够在短时间内准确地对大量样本进行基因分型。

  很简单。借助高质量的 HRM 检测,非遗传学家可以在任何实验室使用具有 HRM 功能的实时 PCR 机器进行强大的基因分型。

  13. 热启动 PCR

  热启动 PCR 是传统聚合酶链式反应 (PCR) 的一种新型形式,可减少由于室温下非特异性 DNA 扩增而导致的不想要的产物的出现和引物二聚体的形成。

  热启动 PCR 的基本原理是将一种或多种试剂从反应混合物中分离出来,直到混合物在加热时达到变性温度。

  热启动 PCR 显着减少了非特异性结合、引物二聚体的形成,并经常增加产物产量。它还需要较少的努力并降低污染的风险。

  14. 原位 PCR

  原位聚合酶链式反应 (In-situ PCR) 是一种有效的方法,可检测冷冻或石蜡包埋的细胞或组织切片中的微量稀有核酸序列,以将这些序列在细胞内进行区室化。

  该方法涉及保留细胞形态的组织固定,然后用蛋白水解酶处理以提供 PCR 试剂作用于目标 DNA 的入口。

  靶序列由试剂扩增,然后通过标准免疫细胞化学方案检测。

  原位PCR适用于传染病的诊断,DNA的定量,甚至微量DNA的检测,广泛应用于器官发生和胚胎发生的研究。

  15. 序列间特异性 (ISS) PCR

  InterSequence-Specific PCR (或 ISSR-PCR) 是一种 DNA 指纹识别方法,它使用从整个基因组中重复的特定片段中选择的引物来产生独特的指纹。

  该技术使用微卫星(通常 16-25 bp 长)作为单引物 PCR 反应中的引物,靶向多个基因组位点,主要扩增不同大小的 inter-SSR 序列。

  ISSR PCR 可用于基因组指纹、遗传多样性和系统发育分析、基因组作图和基因标记。

  16. 反向 PCR

  逆聚合酶链式反应 (Inverse PCR) 是聚合酶链式反应的众多变体之一,当只有一个序列已知时,它用于扩增 DNA。

  常规 PCR 需要与目标 DNA 的两端互补的引物,但反向 PCR 允许进行扩增,即使只有一个序列可供设计引物。

  反向 PCR 涉及一系列限制性消化,然后进行连接,从而产生一个环状片段,然后可以通过已知序列的单个部分为 PCR 引发。

  然后,与其他聚合酶链式反应过程一样,DNA 被温度敏感的 DNA 聚合酶扩增。

  反向 PCR 特别适用于确定宿主 DNA 中各种转座子和逆转录病毒的插入位置。

  17. LATE(线性后指数)PCR

  LATE(Linear-After-The-The-Exponential)PCR 是不对称 PCR 的一种改进,它使用熔解温度高于过量引物的限制性引物,当限制性引物浓度在反应过程中降低时,它可以保持反应效率。

  LATE-PCR 从指数期开始,其中扩增效率与常规 PCR 相似。一旦限制性引物耗尽,反应会突然切换到线性扩增,单链产物会继续进行许多额外的热循环。

  18. 连接介导的 PCR

  连接介导的 PCR 是传统 PCR 的一种改进形式,最初只知道一个末端,然后通过连接独特的 DNA 接头添加第二个末端。

  连接介导的 PCR 利用称为“接头”(或接头)的小 DNA 片段,这些片段最初连接到目标 DNA 的片段上。

  然后使用设计为与接头序列结合的 PCR 引物来扩增目标片段。

  此方法用于 DNA 测序、基因组步行和 DNA 足迹。

  19. 远程 PCR

  长程 PCR 是一种用于扩增较长 DNA 长度的方法,通常无法使用常规 PCR 方法或试剂进行扩增。

  远程 PCR 可以通过使用具有增强 DNA 结合能力的改良高效聚合酶来实现,从而实现长片段的高度加工和准确扩增。

  这种方法允许在更短的时间内放大更多的扩展目标,并有效地利用资源。

  20. 甲基化特异性 PCR (MSP)

  甲基化特异性 PCR (MSP) 是一种检测和分析 CpG 岛中 DNA 甲基化模式的方法。

  为了进行 MSP,DNA 被修饰,并用两个引物对进行 PCR,它们分别是可检测的甲基化和未甲基化 DNA。

  DNA经过亚硫酸氢盐处理,将胞嘧啶转化为尿嘧啶,然后用特异性引物选择性扩增甲基化序列

  甲基化模式的检测是必不可少的,因为启动子中 CpG 二核苷酸的过度甲基化会抑制基因表达。

  21. 微引物 PCR

  一种使用工程聚合酶和 10 核苷酸“小引物”的新 PCR 方法称为小引物 PCR。

  发现这种方法可以揭示用标准引物无法检测到的新型 16S rRNA 基因序列。

  Miniprimer PCR 使用热稳定聚合酶,可以从短引物(9 或 10 个核苷酸)延伸。

  这种方法允许 PCR 靶向更小的引物结合区域,并用于扩增高度保守的 DNA 序列,例如 16S(或真核 18S)rRNA 基因。

  22. 多重 PCR

  多重 PCR 是一种常见的分子生物学技术,用于在一次 PCR 测试中扩增多个靶标。

  在多重 PCR 中,多个引物和温度介导的 DNA 聚合酶用于在热循环仪中扩增 DNA。

  必须优化为多重 PCR 设计的所有引物对,以便在 PCR 过程中所有引物对都具有相同的退火温度。

  当同时针对多个序列时,可以从单个测试运行中生成额外的信息,否则将需要大量的试剂和大量的时间和精力来执行。

  该技术已应用于基因分型、突变和多态性分析、微卫星STR分析、病原体或转基因生物检测等多个领域。

  在诊断实验室中,多重 PCR 可用于检测导致相同类型疾病的不同微生物。

  23. 纳米粒子辅助 PCR (nanoPCR)

  与纳米颗粒相关的 PCR 包括具有增强反应的特定物理特性的小分子物质。

  涉及金纳米粒子的理论之一指出,这些粒子吸附一些聚合酶并控制系统中剩余的聚合酶的量,这可能是增强反应特异性所必需的。

  另一种理论解释说,它们吸附引物对并降低完美配对和错配对引物之间形成双链体时的解链温度,从而提高反应的特异性。

  纳米颗粒关联PCR具有高灵敏度、高特异性和高选择性的优点,已广泛应用于病毒检测和基因测序。

  24. 嵌套 PCR

  嵌套 PCR 是 PCR 技术的一种有用改进,其中通过在两组引物的帮助下防止非特异性结合来增强反应的特异性。

  第一组引物结合在我们的目标 DNA 之外并扩增更大的片段,而另一组引物特异性结合目标位点。

  在第二轮扩增中,第二组引物仅扩增目标 DNA。

  巢式 PCR 是一种用于系统发育研究和检测不同病原体的有用方法。

  该技术具有更高的灵敏度;因此,即使样本含有较低的 DNA,也可以进行扩增,这在传统的 PCR 技术中是不可行的。

  25. 重叠延伸 PCR (OE-PCR)

  这种方法也称为“重叠扩展拼接”或 SOEing。

  重叠延伸 PCR 是一种有价值的技术,通常用于克隆大型复杂片段、对克隆的基因进行编辑或将两个基因元件融合在一起。

  它从较短的 DNA 片段中产生长的 DNA 片段。

  它用于高效的基因克隆和多位点定向大片段插入、删除和替换。

  它被证明可用于定点诱变、嵌合分子的产生,甚至通过将较小的片段拼接在一起来克隆大基因片段。

  26.实时PCR(定量PCR(qPCR))

  定量 PCR (qPCR),也称为实时 PCR 或定量实时 PCR,是一种基于 PCR 的技术,它将靶 DNA 序列的扩增与反应中该 DNA 种类的浓度定量结合起来。

  常规 PCR 是一个耗时的过程,其中 PCR 产物通过凝胶电泳进行分析。qPCR 通过在指数阶段提供产品的实时检测来促进分析。

  实时荧光定量 PCR 的原理取决于荧光染料的使用。

  使用荧光染料或使用荧光标记的寡核苷酸对样品中存在的核酸浓度进行定量。

  q-PCR 应用于病原体的基因分型和定量、microRNA 分析、癌症检测、微生物负荷测试和转基因生物检测。

  27. 基于重复序列的 PCR

  基于重复序列的 PCR (rep-PCR) 是一种改进的 PCR 技术,它使用针对散布在整个细菌基因组中的非编码重复序列的引物。

  这样的非编码重复序列块可以作为寡核苷酸探针的多个遗传靶标,从而能够为单个细菌菌株生成独特的 DNA 图谱或指纹。

  rep-PCR的主要应用是在不同细菌的分子菌株分型中。它还用于各种病原体的流行病学鉴别。

  28. 逆转录酶 PCR (RT-PCR)

  逆转录 PCR (RT-PCR) 是对传统 PCR 的改进,其中 RNA 分子首先转化为互补 DNA (cDNA) 分子,然后可以通过 PCR 扩增。

  在 RT-PCR 中,首先使用逆转录酶将 RNA 模板转化为互补 DNA (cDNA)。然后,该 cDNA 可作为使用 PCR 进行指数扩增的模板。

  RT-PCR 可以在单个试管中进行,也可以在不同试管中分两步进行。一步法更有效,污染和混入变化的机会更少。

  RT-PCR 用于研究方法、基因插入、遗传疾病诊断和癌症检测。

  29. 逆转录酶实时 PCR (RT-qPCR)

  RT-PCR 通常与形成逆转录酶实时 PCR (RT-qPCR) 的 q-PCR 相关联。

  这允许在扩增后实时定量 DNA。

  30. RNase H 依赖性 PCR

  在 RNase H 依赖性 PCR 中,引物在其 3' 端包含一个可移除的扩增块。

  在与互补靶序列杂交期间,封闭的引物只能根据 RNase Henzyme 的切割活性进行扩增。

  RNase H 酶在低温下几乎没有酶活性,无需对 DNA 聚合酶进行任何修饰即可实现热启动。

  类似地,在 RNA 残基附近存在错配时,酶的切割效率会降低。

  因此,在 RNase H 酶的活性下,减少了非特异性结合和引物二聚体的形成,从而实现了有效的杂交。

  31. 单特异性引物 PCR

  单特异性引物PCR (SSP-PCR) 是一种基于PCR 的技术,它允许扩增仅部分序列信息可用的基因。

  它允许单向基因组从已知区域步行到染色体的未知区域。

  32. 单特异性引物-PCR (SSP-PCR)

  即使序列信息仅在一端可用,这也允许双链 DNA 的扩增。

  这种方法,即单特异性引物-PCR (SSP-PCR),允许扩增只有部分序列信息可用的基因,并允许基因组从已知区域单向步行到染色体的未知区域。

  33. 固相 PCR

  固相 PCR (SP-PCR) 是一种独特的 PCR 技术,它允许在固体支持物上扩增目标核酸,其中一个或两个引物固定在表面上。

  引物的空间分离大大减少了不希望的引物相互作用,从而防止了引物二聚体的形成并允许更高的多重扩增。

  这种新方法的中心思想是将引物的 5' 端连接到表面,而不是让引物在散装溶液中自由扩散。

  可以在表面捕获自由扩散的 DNA 靶标,然后由聚合酶复制。

  副本保持附着在表面上,而初始 DNA 分子在退火步骤后返回溶液中。

  附加拷贝的自由端与与其序列互补的引物(连接到表面)杂交,扩增过程可以开始。

  34. 自杀 PCR

  自杀式 PCR 是常用的研究,其中避免假阳性和确保扩增片段的特异性是最高优先级。

  该方法要求在 PCR 中只使用一次任何引物组合,而这不应该在任何阳性对照 PCR 反应中使用。

  这些引物应始终针对在使用该特定引物或任何其他引物组之前从未扩增过的基因组区域。

  这种安排可确保实验室中不存在来自先前 PCR 反应的污染 DNA,否则可能会产生假阳性。

  自杀 PCR 用于古遗传学研究,其中涉及检查古代生物遗骸中保存的遗传物质。

  35. 热不对称交错 PCR (TAIL-PCR)

  TAIL PCR 是一种强大的工具,用于回收与已知序列相邻的 DNA 片段。

  TAIL-PCR 在连续反应中使用三个嵌套引物以及具有低熔解温度的任意简并引物,因此可以热控制特异性和非特异性产物的相对扩增频率。

  该方法准确度高,可以直接对未纯化的 TAIL-PCR 产物进行测序。

  它还允许克隆全长功能基因。

  36. 降落 PCR

  降落 PCR 是 PCR 的一种修改,其中初始退火温度高于引物的最佳 Tm,并在随后的循环中逐渐降低,直到达到 Tm 温度或“降落温度”。

  Touchdown PCR 提高了反应在较高温度下的特异性,并通过降低退火温度提高了效率。

  37. 可变数量串联重复 (VNTR) PCR

  它们是法医学个体化的重要标志。

  在 VNTR PCR 中,扩增的片段在一个物种内几乎没有变化,但在物种之间却表现出差异。

  它可以通过聚合酶链式反应 (PCR) 从极少量的基因组脱氧核糖核酸 (DNA) 中成功扩增。

  在基因分型工具中,基于 PCR 的可变数量串联重复 (VNTR) 分析代表了一种有前途的结核分枝杆菌分型方法。


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