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什么是蛋白质印迹法?(Western印迹的原理与应用)

发布时间:2022-01-17 10:35:18 阅读:119732次 来源:百度学术

  蛋白质印迹是分子生物学、免疫遗传学和其他分子生物学中用于检测组织匀浆或提取物样本中特定蛋白质的分析技术。之所以称为蛋白质印迹法,是因为其过程与 Southern 印迹法相似。Southern印迹用于检测DNA,而Western印迹用于检测蛋白质。Western印迹也称为蛋白质免疫印迹,因为抗体用于特异性检测其抗原。

什么是蛋白质印迹法?(Western印迹的原理与应用)

  免疫印迹原理

  该技术包括三个主要过程:

  按大小分离蛋白质(电泳)。

  转移到固体支持物(印迹)

  使用适当的一抗和二抗标记目标蛋白以进行可视化(检测)。

免疫印迹原理

  电泳用于根据蛋白质的电泳迁移率来分离蛋白质,这取决于蛋白质分子的电荷、大小和蛋白质的结构。蛋白质从凝胶内转移到由硝酸纤维素 (NC) 或聚偏二氟乙烯 (PVDF) 制成的膜上。在没有预活化的情况下,蛋白质基于疏水相互作用(印迹)与硝酸纤维素膜结合。对于蛋白质的检测,使用一抗和酶偶联二抗。除底物外,底物与与二抗结合的酶发生反应,生成有色物质,即可见的蛋白质条带。

  在该技术中,蛋白质混合物通过凝胶电泳根据分子量和类型进行分离。然后将这些结果转移到膜上,为每种蛋白质产生一条带。然后将膜与对感兴趣的蛋白质特异的标记抗体一起孵育。未结合的抗体被洗掉,只留下与感兴趣的蛋白质结合的抗体。然后通过显影胶片来检测结合的抗体。由于抗体仅与感兴趣的蛋白质结合,因此应该只能看到一条带。条带的粗细对应于存在的蛋白质量;因此做一个标准可以表明存在的蛋白质的量。

  蛋白质印迹通常在组织匀浆或提取物上进行。它利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳),一种凝胶电泳,首先根据其形状和大小分离混合物中的各种蛋白质。将由此获得的蛋白质条带转移到硝酸纤维素或尼龙膜上,用对待检测蛋白质特异的抗体“探测”它们。在包含抗体识别的蛋白质的条带上形成的抗原-抗体复合物可以通过多种方式进行可视化。

  如果感兴趣的蛋白质与放射性抗体结合,则可以通过将膜暴露在 X 射线胶片上来确定其在印迹上的位置,这一过程称为放射自显影。然而,最常用的检测程序使用针对蛋白质的酶联抗体。酶-抗体偶联物结合后,添加可产生高度着色和不溶性产物的显色底物会导致靶抗原位点出现有色条带。如果化学发光化合物与合适的增强剂一起用于在抗原位点产生光,则可以以更高的灵敏度确定感兴趣的蛋白质位点。

  Western印迹的应用

  鉴定复杂蛋白质混合物中的特定蛋白质。在这种方法中,分子量明确的已知抗原通过 SDS-PAGE 分离并印迹到硝酸纤维素上。然后用怀疑含有对一种或多种这些抗原特异的抗体的样品探测已知抗原的分离条带。抗体与条带的反应是通过使用放射性标记的或酶联的二抗来检测的,该二抗对测试样品中的抗体种类具有特异性。

  估计蛋白质的大小以及混合物中存在的蛋白质的量。

  它最广泛地用作诊断 HIV 的确认性测试,该程序用于确定患者是否具有与一种或多种病毒蛋白反应的抗体。

  血清中特异性抗体的证明可用于诊断神经囊尾蚴病和结核性脑膜炎。


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