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分子实验-免疫组织化学 (IHC) 原理

2022-01-10 09:56:19
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  免疫组织化学 (IHC) 是一种通过利用抗体与生物组织中的抗原特异性结合的原理来检测组织切片细胞中的抗原或半抗原的方法。抗体-抗原结合可以以不同方式可视化。酶,例如辣根过氧化物酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP),通常用于催化产生颜色的反应。

  IHC 广泛用于许多研究和临床实验室,因为这种技术可以可视化细胞内和适当组织环境中特定细胞成分的分布和定位。有许多 IHC 方法可用于定位抗原。选择的方法应包括对样本类型和检测灵敏度等参数的考虑。

  IHC 检测方法各不相同,并且基于分析报告和结合化学的性质以及其他因素。这里描述了三种方法:免疫荧光法 (IF)、酶法和亲和法。

  免疫荧光法

  Coons 和他的同事在 1941 年开发了 IF 技术。该技术用于通过将抗原暴露于用荧光染料(即荧光染料)标记的已知抗体来快速识别抗原,该抗体在激光(例如氩气)激发时会产生光离子激光器)。特异性抗体结合可以通过产生特征可见光来确定并通过荧光显微镜检测。表 1 和表 2 分别显示了核染色和 IF 的一些常见荧光染料及其相应的激发 (λex) 和发射波长 (λem)。

表 1:核染色常用荧光染料

  Coons 和他的同事在 1941 年开发了 IF 技术。该技术用于通过将抗原暴露于用荧光染料(即荧光染料)标记的已知抗体来快速识别抗原,该抗体在激光(例如氩气)激发时会产生光离子激光器)。特异性抗体结合可以通过产生特征可见光来确定并通过荧光显微镜检测。表 1 和表 2 分别显示了核染色和 IF 的一些常见荧光染料及其相应的激发 (λex) 和发射波长 (λem)。

表 2:用于 IF 标记的常用荧光染料

  原则

  间接染色过程包括三个步骤

  一抗与靶抗原特异性结合

  用荧光团标记的二抗与一抗结合

  通过显微镜检测荧光团

  协议

  将样品固定在载玻片上(为确保荧光染色的有效性,应进行阳性、阴性和样品自发荧光对照,以确认没有非特异性结合。)

  添加适当稀释的一抗以覆盖样品

  将载玻片放入湿盒中,37℃孵育 1-2 小时

  用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗载玻片 3X,每次 5 分钟

  去除样品上多余的水(但保持湿润)

  用适当稀释的二抗覆盖样品

  将载玻片放入湿盒中,37℃孵育 30-60 分钟

  用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗载玻片 3X,每次 5 分钟

  去除样品上多余的水(但保持湿润)

  在样品中加入缓冲甘油(封固剂)并用盖玻片封固

  在荧光显微镜下查看盖玻片

  提示:荧光显微镜的操作

  不可见或微弱的自发荧光

  清晰可见的荧光

  明亮可见的荧光

  耀眼的可见荧光

  根据手册操作显微镜

  使用前打开汞灯5-15分钟以稳定光源

  调整光源时戴上防护眼镜,避免紫外线对眼睛有害

  高压汞灯使用时间超过 90 分钟,强度会下降(通常连续使用 1-2 小时)

  样品被高压汞灯照射超过3分钟就会出现光漂白现象(注:样品一般在荧光染色后1小时内观察到)

  由于光源有限,请集中观察样品以节省时间

  关闭光源 30 分钟或更长时间后重新启动光源

  避免在一天内多次使用光源

  染色后立即观察样品

  荧光强度有四个级别:

  核复染

  荧光染色后应进行复染,使细胞和组织的形态结构清晰,特异性荧光更易观察。一些复染荧光染料是:

  染色样品储存

  染色后,应立即在荧光显微镜下观察和成像样品。如果不立即拍摄图像,则应将它们安装在缓冲的甘油介质中,并在 4℃ 下保存不到一周。如果将抗荧光衰减介质应用于样品,则荧光信号可能在一个月内不会显着衰减。

  DAPI:经典的蓝色复染剂,广泛用于细胞核和染色体染色(DAPI 选择性结合 dsDNA,而不会在细胞质中进行背景染色;DAPI 对活细胞具有半渗透性,可用于对固定细胞和/或组织切片进行染色)

  Hoechst 33342:主要复染剂,用于对抗黄色荧光

  Propidium iodide:初级复染剂,用于细胞核和染色体对黄色/红色荧光的染色

  复染和染色样品储存

  酶法

  酶促 IHC 技术由 Nakane 和 Pierce 于 1967 年引入。它通过利用抗体与抗原特异性结合的原理来识别感兴趣的抗原。酶标记物与底物反应,产生可分析的强烈着色产物。酶促技术的开发原理与 IF 技术相似,但两者不同,因为酶促方法使用酶标记抗体。与 IF IHC 相比,酶促 IHC 的优势在于:

  不需要荧光显微镜

  通过更好的对比度实现准确的抗原定位

  染色样品可以保存很长时间

  苏木精可用作增强组织形态研究的复染剂

  最终产品的颜色可以通过光学显微镜轻松识别和观察(由于电子密度高,也可以通过电子显微镜)

  可实现双重和多重染色

  标记酶抗体

  对于这种方法,用于抗原检测的抗体在反应前已经用酶进行了标记。与靶向抗原反应后,标记的抗原形成抗原-抗体复合物,其中酶催化底物产生不溶性有色产物。随后,产品可以通过光学显微镜或电子显微镜进行分析。标记酶方法可以通过直接或间接检测来完成。

  直接检测

  直接法是一步染色法,涉及标记抗体(例如 HRP 偶联抗体)与目标抗原直接反应。然后使抗原-抗体-HRP复合物与DAB底物反应以进行染色。

  虽然直接法简单、快速且特异性高,但灵敏度低,直接标记的一抗范围有限。尽管存在缺点,但直接方法通常用于在大规模制造过程之前筛选单克隆抗体。

  间接检测

  间接方法是一个两步过程,包括与样品中的靶抗原结合的未标记的一抗(第一层)和与一抗反应的酶标记的二抗(第二层)。二抗必须针对已产生一抗的动物物种的 IgG 产生。例如,如果一抗是兔抗人 IgG,则酶标二抗可以是山羊抗兔 IgG。

  与直接检测相比,间接检测具有许多优点。首先,间接法只需要生成相对少量的标准偶联(标记)二抗。例如,针对兔 IgG 产生的标记二抗(可以“现成”购买)适用于在兔体内产生的任何一抗。使用直接方法,有必要为每个感兴趣的抗原标记每个一抗。其次,间接法具有更高的测定灵敏度。第三,可以设计各种控制并应用间接检测。

  未标记酶抗体

  组织抗原特异性抗血清 (AnTAn)

  AnTAn 种属免疫球蛋白抗血清

  与AnTAn同种酶标制备的特异性抗血清

  酶标

  酶桥法

  TE Mason 和他的同事在 1969 年发表的一篇文章中描述了这种方法,该方法基于通过免疫球蛋白-酶桥的抗原-抗体反应将酶标记与靶抗原结合,该桥由以下成分组成:

  过氧化物酶-抗过氧化物酶 (PAP) 法

  该方法涉及用 HRP 部分免疫兔/山羊/大鼠抗体以产生抗 HRP 兔/山羊/大鼠抗体,然后该抗体将与另一个 HRP 部分结合以形成稳定的多边形。PAP 方法因其高灵敏度和低组织染色背景而表现出色。

  协议

  将样品固定在载玻片上(为确保荧光染色的有效性,应进行阳性、阴性和样品自发荧光对照,以确认没有非特异性结合。)

  添加适当稀释的一抗以覆盖样品

  将载玻片放入湿盒中,37℃孵育 1-2 小时

  用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗载玻片 3X,每次 5 分钟

  去除样品上多余的水(但保持湿润)

  用适当稀释的二抗覆盖样品

  将载玻片放入湿盒中,37℃孵育 30-60 分钟

  用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗载玻片 3X,每次 5 分钟

  去除样品上多余的水(但保持湿润)

  在样品中加入缓冲甘油(封固剂)并用盖玻片封固

  在荧光显微镜下查看盖玻片

  提示:荧光显微镜的操作

  不可见或微弱的自发荧光

  清晰可见的荧光

  明亮可见的荧光

  耀眼的可见荧光

  根据手册操作显微镜

  使用前打开汞灯5-15分钟以稳定光源

  调整光源时戴上防护眼镜,避免紫外线对眼睛有害

  高压汞灯使用时间超过 90 分钟,强度会下降(通常连续使用 1-2 小时)

  样品被高压汞灯照射超过3分钟就会出现光漂白现象(注:样品一般在荧光染色后1小时内观察到)

  由于光源有限,请集中观察样品以节省时间

  关闭光源 30 分钟或更长时间后重新启动光源

  避免在一天内多次使用光源

  染色后立即观察样品

  荧光强度有四个级别:

  复染和染色样品储存

  核复染

  荧光染色后应进行复染,使细胞和组织的形态结构清晰,特异性荧光更易观察。一些复染荧光染料是:

  DAPI:经典的蓝色复染剂,广泛用于细胞核和染色体染色(DAPI 选择性结合 dsDNA,而不会在细胞质中进行背景染色;DAPI 对活细胞具有半渗透性,可用于对固定细胞和/或组织切片进行染色)

  Hoechst 33342:主要复染剂,用于对抗黄色荧光

  Propidium iodide:初级复染剂,用于细胞核和染色体对黄色/红色荧光的染色

  染色样品储存

  染色后,应立即在荧光显微镜下观察和成像样品。如果不立即拍摄图像,则应将它们安装在缓冲的甘油介质中,并在 4℃ 下保存不到一周。如果将抗荧光衰减介质应用于样品,则荧光信号可能在一个月内不会显着衰减。

  亲和法

  通过使用更多数量的与组织结合的酶分子,可以提高 IHC 灵敏度。在这方面,抗生物素蛋白和生物素化抗体之间的多个结合位点已被用于 IHC 信号放大。抗生物素蛋白是一种蛋清蛋白,具有四个结合位点,可与低分子量维生素生物素形成大的晶格状复合物。除了抗生物素蛋白,还有其他方法涉及链霉抗生物素蛋白,它是一种从抗生物素链霉菌中分离出来的四聚体生物素结合蛋白。亲和素和链霉亲和素方法的工作原理几乎相同,因为它们的结构非常相似(它们几乎没有氨基酸同源性)。抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物 (ABC) 和标记的链霉抗生物素蛋白结合 (LSB) 是用于放大靶抗原信号的两种最广泛使用的亲和方法。

  该方法包括四个连续的步骤

  将一抗与组织样本一起孵育以与靶抗原结合

  将生物素化二抗(对一抗具有特异性)与组织样本一起孵育,以与一抗结合

  生物素化酶(HRP 或 AP)与游离抗生物素蛋白预孵育以形成大的 ABC 复合物(生物素化酶和抗生物素蛋白以预定比例混合在一起以防止抗生物素蛋白饱和)

  将上述预孵育溶液与组织样品孵育

  最低位

  该方法使用酶标记的链霉亲和素来检测组织切片上结合的生物素化一抗。如果 ABC 方法中的复合物太大而无法穿透组织,也可以应用它。由于其较小的尺寸,酶标记的链霉亲和素用于实现组织穿透。LSB 方法可以用来代替 ABC 方法,因为前者能够进一步提高灵敏度并进一步降低信号。以下信息描述了一般染色程序。

  将一抗与组织样本一起孵育以与靶抗原结合

  将生物素化二抗(对一抗具有特异性)与组织样本一起孵育,以与一抗结合

  将链霉亲和素-酶偶联物与组织样品孵育

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