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分子实验-免疫组织化学流程步骤

发布时间:2022-01-10 10:02:39 阅读:15762次 来源:百度学术

  免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)是基于抗原抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色来对组织内抗原进行定位、定性、定量的一项技术。

  根据抗原抗体反应和化学显色原理。从待测组织或细胞中提取蛋白作为抗原,先与一抗结合形成抗原抗体反应物,再与生物素或荧光素标记的二抗反应,通过化学显色可以在显微镜下清晰观察到抗原抗体反应物,从而能在组织切片上确定抗原的分布和含量。

  免疫组化材料的准备

  切片的选择

  石蜡切片:通过石蜡包埋固定好的组织标本,并用切片机切片的方法。是制作组织标本最常用、最基本的方法。能保存好组织形态且可以做连续切片,有利于各种染色对照观察,并且可以长期存档做回顾性研究。但高温烤片可能会破坏组织的抗原性。

  冰冻切片:在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度,然后进行切片的一种方法。能较好保存组织的免疫活性,在免疫组化时不需要抗原修复。但细胞内易形成冰晶破坏细胞结构,可能会使抗原弥散,切片较厚不美观。

  抗体的选择

  单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对较低;而多克隆抗体特异性稍弱,抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性染色。

  种属来源:根据一抗的来源决定二抗的选择。若一抗是小鼠来源,那么二抗选择抗小鼠的即可(例如羊、兔)。

  根据实验目的是检测什么种属的抗原选择抗体,避免出现交叉反应。

  购买之前咨询该抗体是否可以做免疫组化。

  一般可以做石蜡切片的抗体都可以用来做检测冰冻切片,但可以做冰冻切片的抗体不一定能检测石蜡切片。

  免疫组化实验流程

  实验步骤主要包括样品制备以及样品染色(以石蜡组织切片为例)

  样品制备

  组织固定:根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析,冲洗并用固定剂(一般用甲醛)进行固定

  组织包埋:将经甲醛固定的组织嵌入石蜡,以长期保持其天然形状和组织结构

  切片安装:将组织样品在切片机上切片,并转移至载玻片上干燥保持其形态

  脱蜡水化:因切片上的石蜡会妨碍染色,所以需将切片上的石蜡溶出,并水化。脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色(一般的脱蜡水化步骤是:将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3,进行脱蜡水化)。

  抗原修复:由于组织在甲醛固定过程中,蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。可以通过高压加热修复抗原,使细胞内抗原决定族暴露,从而提高抗原检测率

  非特定位点封闭:为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性,可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。封闭血清来源一般与二抗保持一致,室温封闭10-30min

  样品染色

  一抗、二抗孵育:抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。在4℃下反应缓慢,背景较浅;37℃反应较快时间较短;而室温介于两者之间,选择室温有利于实验的进行。二抗一般室温孵育30min

  底物显色:基于与酶缀合的二抗,抗原通过生色或荧光方式直接检测

  复染封片:组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构,常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。观察结束后使用中性树胶进行封片,可以长久保存

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/691.html

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