免疫荧光 ( IF ) 涉及用特异性一抗和荧光染料偶联的二抗标记细胞蛋白（间接方法）或用直接偶联的一抗进行标记（直接方法）。大多数荧光显微镜允许检查单个样品中两种或三种荧光标记蛋白质的亚细胞定位、相对表达水平和/或活化状态（例如磷酸化状态）。在研究组织中具有多个标记的细胞子集时，执行多重分析的能力消除了对连续切片的需要，从而节省了时间和试剂。Cell Signaling Technology ( CST ) 的科学家已经验证了800 种激活状态特异性（例如磷酸化特异性）和总蛋白抗体，适用于IF应用，例如手动荧光显微镜或自动成像和激光扫描高内涵平台。所有获准用于免疫荧光检测的CST ™ 抗体都经过了严格的验证过程。
免疫荧光的抗体验证包括
具有已知靶表达水平的细胞系或组织用于验证特异性。
使用适当的细胞系和组织来验证亚细胞定位。
在适当的组织上评估抗体性能。
对细胞进行磷酸酶处理以验证磷酸化特异性。目标特异性也通过使用已知的敲除或无效细胞系进行验证。
对细胞进行 siRNA 处理或过表达目标蛋白以验证目标特异性。
使用配体或抑制剂检查激活状态规范、目标表达和易位以调节通路活性。
对抗体阈值信噪比的要求：同种型比较和磷酸化特异性抗体的最小倍数诱导可确保最大可能的灵敏度。
优化固定和通透条件；如有必要，建议使用替代方案。
严格的测试可确保批次间的一致性。
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