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分子实验-组织免疫荧光方案

发布时间:2022-01-08 10:30:00 阅读:110402次 来源:百度学术

  免疫荧光利用带有荧光染料的抗体的特异性来识别其抗原,因此可以通过荧光染料在荧光显微镜下观察目标分子的分布。免疫荧光被广泛用作免疫染色的一个例子,并且是免疫组织化学的一个具体例子,它利用荧光团来可视化特殊生物分子的位置。有两类免疫荧光技术,包括直接和间接。

  以下是组织和单层细胞中间接免疫荧光的协议。

  免疫荧光协议

  材料

  10 PBS (pH 8.0)。

  甲醛:16%,不含甲醇,新鲜使用,开瓶后在 4°C 避光保存,在 PBS 中稀释备用。

  封闭缓冲液:(1? PBS,含 5% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100):加入 2.5 ml 10X PBS,1.25 ml 来自与二抗相同物种的正常血清(例如,正常山羊血清、正常驴血清) 和 21.25 ml ddH2O 并充分混合。在搅拌的同时,加入 75 µl Triton X-100。

  抗体稀释缓冲液(1? PBS 含 1% BSA 和 0.3% Triton X-100):加入 4 ml 10? PBS 和 120 µl Triton X-100 加到 0.4 g BSA。用 ddH2O 使最终体积达到 40 ml,并充分混合。

  一抗和二抗。

  延长抗褪色试剂。

  组织或细胞样本

  组织免疫荧光方案

  对于器官组织的免疫荧光标记,使用多聚甲醛固定和石蜡包埋方案。器官是通过解剖获得的。

  然后,通过轻轻去除所有 PBS 以及孵育室,使解剖的器官完全粘附在载玻片表面。

  在器官脱水前,将载玻片快速浸入冷 (-20°C) 丙酮中 5 分钟。

  将含有 1% Triton X-100 的 PBS 添加到载玻片中,并在组织周围使用 PAP 笔环以尽量减少试剂量。

  载玻片在由培养皿和 PBS 湿纸制成的加湿室中于 4°C 下孵育过夜。

  第二天早上,载玻片在 PBS 中洗涤 3 次并用于免疫定位。

  载玻片在封闭缓冲液(PBS、0.1% Triton X-100、10% 正常山羊血清)中孵育 30 分钟,然后与针对靶蛋白的一抗孵育 2.5 小时。按照制造商的建议将一抗应用于稀释的载玻片。

  然后将载玻片在 PBS 中洗涤 3 次,并与二抗一起孵育。根据所用一抗的类型,二抗用不同的荧光基团进行标记。也按照制造商的建议应用二抗。

  载玻片在 PBS 中洗涤 3 次,在水中漂洗并用含有 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的 ProLong® 金抗褪色封固剂封固以对细胞核进行复染。

  然后在荧光显微镜下观察载玻片。

  单层细胞的免疫荧光方案

  在免疫荧光程序之前,在盖玻片上培养和制备单层细胞。

  将细胞用 PBS 洗涤两次,并在室温下用 3% 多聚甲醛固定 12 分钟。

  然后通过在 PBS 中用 100 mM 洗涤盖玻片两次来淬灭多聚甲醛。用 PBS 再次洗涤后,用 PBS 中的 2% 血清封闭盖玻片 1 小时。

  用 PBS 清洗盖玻片两次。

  按照制造商的建议在室温下用初级抗体孵育盖玻片。

  然后用 PBS 洗涤四次,并与结合适当荧光基团的二抗孵育。按照制造商的建议使用二抗。

  用 PBS 清洗盖玻片 3 次。

  使用 ProLong Antifade 将盖玻片安装到载玻片上。用荧光显微镜观察荧光。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/680.html

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