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分子实验-pcr扩增效率怎么计算(​PCR常见问题汇总)

发布时间:2022-01-07 09:55:20 阅读:119082次 来源:百度学术

  做过PCR的小伙伴都知道,PCR前期的验证引物探针性能和确定最适反应条件是确保正式实验顺利进行的前提。PCR实验中有个相当重要的工作——即是PCR扩增效率的评估。扩增效率是PCR检测性能最重要的指标之一,也是定量分析计算结果时所需要的参数。接下来,让小编给大家细细说来吧。

pcr扩增效率怎么计算

  什么是扩增效率

  PCR是一种DNA体外扩增技术,通常包括了30 - 50个循环周期。每个循环中,目标DNA分子的拷贝数最多会增加1倍。但在实际反应中,1个DNA分子在1个扩增循环后被成功复制的概率,也就是扩增效率E<1。而PCR的特点是反应初期目标DNA分子呈现指数增长,这个阶段的扩增效率可以无限接近于1;随后由于反应组分消耗或聚合酶活性下降或两者共同作用,导致反应效率逐渐下降并最终停止。不管是定量DNA分子初始量,还是计算表达量差异,都需要精确评估PCR扩增效率。

pcr扩增效率怎么计算

  如何评估扩增效率

  标准曲线是评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法,被研究者们广泛认可。该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。这些样品通常由浓缩的原液连续稀释而成,最常用的是10倍稀释。使用一系列稀释样品,采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值,最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线,得到线性方程Cq= -klgX0+b,扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时,要求扩增效率范围在90%-110%(3.6>k>3.1)。

  影响扩增效率的关键因素

  PCR的效率取决于许多因素,包括以下方面:

  1)检测的性能。这取决于引物、模板的序列和结构。二级结构和分子间的相互作用都会降低PCR效率。

  2)样品基质。其中可能含有来自样品的抑制剂和其他干扰物质,或携带来自上游加工步骤的试剂。检测样品是否有抑制作用,可使用RNA或DNA Spikes方法进行检测,或者通过倍比稀释得到标准曲线也可以观察到。

  3)所用试剂及其浓度。本质上,任何PCR试剂都会一定程度上限制PCR反应速率和性能。

  4)竞争性反应。多重反应时,各基因的扩增存在反应成分的竞争。

  5)qPCR仪器。由于仪器特定的硬件/软件属性和设置、以及用于提取Cq值的特定算法不同,相同的实验中,不同的仪器会产生不同的PCR效率。

  6)技术重复。一般进行3次以上的技术重复以校正实验误差,重复数越多精确度越高。

  7)连续稀释中的移液体积。移液体积越大,移液器误差或操作误差引起的影响越小。

  qPCR扩增效率的判断

  qPCR扩增效率主要是通过标准曲线的线性关系方程Cq=-klgX0+b来判断,扩增效率E在90%-110%之间时,认为扩增接近理想情况;参数R2要求≥0.98,R2越接近1,则说明Cq和X0的Log值之间的相关性越高。

  那么扩增效率E表现不好,主要分为两种情况:

  1)过低的扩增效率(<90%)

  可能存在的原因:

  移液器校准不良或移液技术差。

  不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

  染料浓度低荧光或者仪器未校准染料。

  引物设计不好或扩增子具有二级结构。

  标准曲线动态范围太小。

  Taq酶无活性或活性降低。

  样品抑制。

  2)过高的扩增效率(> 110%)

  可能存在的原因:

  移液器校准不良或移液技术差。

  不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

  引物二聚体或非特异性扩增。

  标准曲线动态范围太小。

  基因组DNA污染(仅限RNA模板未进行DNase I处理或DNase I消化不完全)。

PCR常见问题汇总

  1. 无扩增条带

  (1)酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

  (2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

  (3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。

  (4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。

  (5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。

  (6)引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

  (7)DNA凝胶电泳时加入阳性对照,确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

  2. PCR产物量过少

  (1) 退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

  (2) DNA模板量太少。增加DNA模板量。

  (3) PCR循环数不足。增加反应循环数。

  (4) 引物量不足。增加体系中引物含量。

  (5) 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

  (6) 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

  (7) DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

  3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

  (1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。

  (2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

  (3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

  (4)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。

  (5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

  (6)循环次数过多;增加模板量减少循环次数至30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。

  (7)退火温度过低。

  (8)电泳体系有问题:

  ①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;

  ②凝胶没有凝固好;

  ③琼脂糖质量差。

  (9)若为PCR试剂盒则可能:

  ①由于运输储存不当引起试剂盒失效;

  ②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。

  (10)降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

  4. 扩增产物出现多条带 (杂带)

  (1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

  (2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。

  (3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。

  (4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

  (5)样品处理不当。

  (6)Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。

  (7)若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。

  (8)复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

  (9)反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

  (10)引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

  (11)引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

  (12)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。

  (13)外源DNA污染。确保操作的洁净。

  5.阴性对照出现条带

  试剂,枪头,工作台污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。

  6.条带大小与理论不符

  1) 污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。

  2) 模板或引物使用错误。更换引物和模板。

  3) 基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。



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