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分子实验-简述pcr扩增技术的原理(实时荧光PCR核酸检测技术)

发布时间:2022-01-07 10:01:05 阅读:111222次 来源:百度学术

  如果要想成功的完成一次PCR扩增实验,那么就少不了引物、酶、dNTP、模板、Mg2+等基本要素。

简述pcr扩增技术的原理

  引物

  首先引物决定了PCR扩增片段的长短,也是PCR扩增特异性的关键;那么要想保证PCR扩增的特异性,引物就一定要与模板DNA具有完全的互补性。如果模板DNA的核苷酸序列是已知,那就能按照其序列设计合成一定长度的互补寡核苷酸链做引物,从而将特定长短的靶DNA在体外扩增。

  引物的长度:一般以18~30bq为宜,以20bq左右的较为常用。引物过短,易导致非特异扩增。引物较长的话其特异性虽好,但也易引起二级结构。

  引物的G+C的比例和碱基:G+C含量需适宜,在40%~60%为宜;G+C比例太高容易出现非特异条带;太低,扩增效果不佳。ATGC四个碱基随机分布比较好。

  引物的熔解温度(TM):与长度、序列组成和浓度有关。理想的TM在55~60℃。TM对PCR扩增的特异性影响较大。TM较高时:扩增效率会降低,甚至不出现扩增;TM过低:可能出现错误的扩增引导。

  引物的量:每条引物的的浓度不易过高,较低的引物浓度比较理想;引物浓度偏高易导致错配和非特异扩增。

PCR的扩增体系

  酶

  用于PCR的耐热DNA聚合酶可分两类,一类是从水生嗜热菌中纯化的TapDNA聚合酶;一类是通过基因工程在大肠埃希菌中表达的酶。酶的浓度过高可导致非特异扩增;过低则扩增效率减低,产物减少。

  dNTP

  dNTP是dATP、dGTP、dTTP、dCTP四个的总称,N代表其中一个。原料一般为颗粒状粉末,应在适当条件下保存。dNTP溶液呈酸性,是由dNTP粉末配置而成。4种dNTP浓度必须是等摩尔的。任何一种偏高或偏低都会引起错配。

  模板

  模板的量与纯度也是PCR扩增成功与否的关键,一个PCR反应管内应该至少有一分子模板DNA;靶核酸通常是提取体液和组织标本中的细胞DNA。标本中一般含有大量对PCR有抑制作用的蛋白质和脂质等物质;通常采用SDS和蛋白酶K来处理标本;SDS是一种对人体有微毒的阴离子表面活化剂,主要作用是溶解细胞膜上的脂质与蛋白质,进而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白。蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的蛋白质。RNA一般是采用异流氰酸胍或蛋白酶K法,可以防止RNase降解RNA。

  Mg2+

  Mg2+是Taq的DNA聚合酶不可缺少的辅助因子,不但影响PCR扩增效率,也影响扩增的特异性。Mg2+过高,酶活性增强,易出现非特异扩增,反应的特异性将减低;Mg2+过低,则会降低酶的活性,使扩增产物减少。

  当然,除了这五个基本的要素因子,还有PCR的扩增参数等等。

实时荧光PCR核酸检测技术

  考虑到时效、成本等问题,全基因组测序并不适用于发热门诊、传染病区和隔离病区中的防治。在这方面,各种体外诊断(IVD,in vitro diagnosis)检测技术能起到简便、快速的作用。其中,实时荧光PCR核酸检测技术就是目前疫情中被采用的主要方法。

  据武汉市卫健委1月19日的媒体发布会消息,在不明原因的病毒性肺炎被确定为新型冠状病毒感染所致后,国家相关科研机构迅速研发出病毒核酸检测试剂盒,这有效提高了疑似病例的检验速度。与此同时,我国有多家企业生产出基于荧光PCR的核酸检测试剂。

  据界面新闻的报道,国家卫健委已确定三家检测公司为新型冠状肺炎病毒核酸检测试剂盒的供应方,并被多家疾控中心认可与使用。这三家企业分别是上海辉睿生物科技有限公司、上海捷诺生物科技有限公司与上海伯杰医疗科技有限公司。核酸检测试剂的快速开发,为控制疫情发挥了重要作用。

  下面说说有关实时荧光PCR核酸检测技术的原理:

  首先关于PCR,即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。类似DNA复制,PCR可用于体外扩增特定的DNA片段。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/673.html

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