免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素,酶,金属离子,同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位,定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry).

　　免疫组化的作用是什么呢？

　　由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。

　　免疫组化实验步骤

　　固定

　　固定的目的是为了使蛋白质凝固，减少或终止内源性/外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保存组织或细胞内的抗原性。现在常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好的效果，如苦味PLP固定液对于含糖组织保存更好，Helly固定液对于胰岛和垂体效果较好等。

　　脱水、石蜡包埋和制片

　　脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水，对于一些易脆的组织应减少高浓度酒精里的停留时间，透明的时间也应该控制缩短。对组织浸蜡时，一般选用56℃-58℃熔点石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。包埋时应果断迅速，切片时注意检查刀片是否出现缺口，防止；蜡带出现裂痕。

　　脱蜡和水化

　　使组织恢复到固定后的正常状态暴露抗原，方便与一抗结合。若脱蜡与水化不完全易出现局灶性反应和浸洗不完全，产生非特异性背景着色。

　　抗原修复

　　由于组织在甲醛或多聚甲醛在固定中，发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率，常用方法通常使用高压加热修复，使用高压加热修复对修复温度和时间的把握十分重要，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。修复结束后注意室温冷却，让蛋白自然复性。另外，大家尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆影响。

　　标本固定

　　传统的免疫组化法容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须对其进行灭活和封闭。灭活内源性过氧化酶一般用3%过氧化氢灭活10min左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。

　　血清封闭

　　血清封闭的目的是为了一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性，一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点，封闭血清一般是和二抗同一来源的，室温封闭10-30min。

　　一抗和二抗浓度和孵育时间

　　不同的一抗浓度，孵育时间和温度等对染色结果往往有较大的影响。在4℃下，反应缓慢，背景较浅；而37℃反应较快，时间较短；室温介于两者之间，二抗一般室温孵育30min。

　　DAB显色

　　检测背景的深浅和特异性染色的深浅基本上都以DAB孵育条件决定。DAB的显色时间并不是固定的，主要方法是使用显微镜控制显色时间，到出现特异性染色较强且出现背景着色较浅时就可以冲洗。如果DAB显色时间过长（超过十分钟）才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长，也可以加入金属离子来增强显色（如硫酸铜、氯化钴、硫酸镍铵等）；如果DAB显色时间过短颜色就很深，这可能是一抗过高，需要下调抗体浓度，如果短时间内过深。

　　复染

　　免疫组化染色后为了衬托出组织形态结构有必要进行复染，常用试剂为Mayer’s苏木染色，一般为2 min左右，DAB在核蛋白着色的时间可以适当缩短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返蓝。

　　封片

　　在封片阶段我们通常是用中性树胶来进行，封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡的产生从而对结果进行营影响，建议最好在通风橱操作，这样有利于气泡排除干净，不影响后续的镜检。