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实验外包:免疫荧光实验(间接免疫荧光法原理)

发布时间:2021-11-11 10:20:05 阅读:18492次 来源:百度学术

  间接免疫荧光试验是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后,再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原-抗体复合物中第一抗体结合,洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光,以检测未知抗原或抗体。本法比直接法敏感度提高5-10倍,且一种荧光二抗可检测多种抗原抗体系统,缺点是易产生非特异性荧光。

  直接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的异同

  1、接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的不同:

  直接免疫荧光的实验方案通常较短,因为它只需要一个标记步骤。间接免疫荧光使用偶联二抗检测一抗会增加额外的操作步骤。

  直接免疫荧光方法的实验方案步骤较少,更简单。间接免疫荧光方法中必须选择适当的二抗,增加了复杂度。这种情况在需要使用多个二抗的多色实验中尤为突出,每个二抗需要靶向不同的物种并偶联至不同染料。

  直接免疫荧光方法中获得的信号与间接方法相比可能较弱,因为直接方法中没有使用二抗进行信号放大。免疫荧光多个二抗结合一抗可使信号放大。

  2、直接免疫荧光和间接免疫荧光染色方法的相同之处:

  免疫荧光(IF)或细胞成像技术使用抗体将荧光染料(也称为荧光素或荧光物)标记到特异性目标抗原上,所用荧光染料有诸如异硫氰酸荧光素(FITC)等。而通过化学方法偶联荧光素的抗体被广泛使用于IF实验中。

  根据荧光素与一抗还是二抗偶联,我们将IF方法分为两类:直接IF-使用单个抗体,该抗体直接指向目的靶标,一抗与荧光素直接偶联;间接IF-使用两个抗体,一抗未偶联,荧光素偶联的二抗指向一抗,并用于检测。

  间接法测抗体基本原理:

  染色程序分为两步,第一步,用未知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原标本上,在湿盒中37℃保温30min,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的抗体。

  第二步,加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应,标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合,从而可鉴定未知抗体。

  参考资料来源:

  百度百科——免疫荧光间接染色原理

  直接免疫荧光是什么?

  a) 直接免疫荧光(DIF):原理、表现——棘细胞间渔网状荧光

免疫荧光实验

  免疫荧光技术的重要意义?

  近年来生物化学,免疫荧光技术、免疫酶标技术、PCR试验等,对皮肤发病机制的研究有重要意义。

  细胞爬片免疫荧光步骤:

  1.细胞爬片;首先是玻片的处理,普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块,先用洗衣粉洗干净,用水冲静烤干,然后泡酸过夜,捞酸后流水洗净,烤干,置于器皿中高压灭菌,然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

  爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可,我选择在培养皿中爬。一为节约经费(培养皿可以重复利用)二来觉得培养皿口大,操作比较方便。培养皿消毒同上,消毒时记得消两把镊子

  具体操作是:用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成单细胞悬液(注意:这一点很重要,关系到将来爬出来片子的质量)

  取出消毒的培养皿,可以先加少量培养基(以使玻片与培养皿紧密接触),将玻片小心放入摆放其中,然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5%CO2的暖箱中培养,根据细胞生长状况,24小时或更长时间适时取出爬片。

  爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4%多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲干净,注意手法轻柔,要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功尽弃。

  将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验,要不然玻片会掉下来的,就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在-20保存备用,具体能保存多长时间不太清楚,当然尽量早用。

  2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮);

  3.PBS漂洗5min;

  4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理);

  5.PBS漂洗2次,每次5min;

  6.1%BSA封闭30min;

  7.加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h;

  8.PBS漂洗2次,每次5min;

  9.加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h;

  10.PBS漂洗2次,每次5min;

  11.5ug/ml DAPI染色2min;

  12.抗淬灭封片剂封片。

  抗淬灭封片剂:

  2.5% DABCO (w/v)

  50mM Tris(pH8.0)

  甘油细胞免疫荧光的详细操作步骤

  1,取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,pbs洗三遍。注意有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心。

  2,4%多聚甲醛固定20分钟,pbs洗三遍。

  3,0.2%triton x 100通透10分钟,pbs洗三遍。

  4, 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟,pbs洗三遍。

  5.,一抗4度湿盒内过夜,也可37度2小时,感觉前者效果好,pbs洗三遍。

  6,二抗室温2小时,或者37度1半小时,pbs洗三遍。

  7,最好用dapi染核,然后直接照荧光片。

  8,蒸馏水洗掉pbs,甘油封片,指甲油封片子的四周。

  哪些实验需要用到免疫荧光定位实验

  核蛋白的免疫荧光定位实验童鞋这个问题有一点奇怪哦(我不知道你是否其实想问的是抗体等试剂的用量)。

  你所说的免疫荧光实验,标本应该是细胞。理论上来说细胞的数量只要能够覆盖显微镜最低倍数的视野就可以了。实际上染色的当然要比一个视野多很多,才能选取质量好的图像。一般来说,12-13毫米直径的玻片刚好能够放进24孔板,是做免疫荧光常用的大小。这个面积上面种多少细胞,同你的细胞类型及其单个细胞大小有关。做免疫荧光的话,细胞不应该长得太密。我估计你每个样本有几万个细胞就够了。

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