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实验外包:miRNA、lncRNA和circRNA研究方案

发布时间:2021-09-17 02:16:01 阅读:15512次 来源:本站

  miRNA、lncRNA 和 circRNA 已成为研究的大热门,也是近年来国自然申请标书中的香饽饽。这两个非编码RNA家族的重要成员以多种方式调节生命活动,包括转录调节、转录后调节、翻译调节、蛋白质定位等。对其功能和机制的系统研究有助于我们更全面、更深入地理解基因表达调控机制和生物的生命活动。但是该如何进行miRNA、lncRNA 和 circRNA 研究呢?Bybiotech整理了一些科研大咖们的经验之谈,供大家参考!

  关于miRNA、lncRNA、circRNA的研究,基本脱离不了以下几步:

  1、初步小样本测序或者芯片或者panel,这个筛选,当然,一般还会伴随mRNA的差异筛选

  2、大样本PCR验证

  3、功能研究(细胞和动物模型)

  第一步,基本就是文章的基础,也是烧钱阶段;而这一步一般还需要生物信息学技术支持,尤其是Gene Ontology和KEGG,已经其他各种预测软件等,如mirbase,circbase,lncRbase,starbase等,这些软件,前前后后估计差不多上百个了,不需要会太多,搞懂一两个基本就可以了;还有个软件Cytoscape,这个功能强大,学会了不得了。

  第二步,大样本PCR验证,这个基本就是现在好多实验的终点,基本很多都是在这一步后就发文章了;很多就是发现一个ncRNA可以作为biomarker或者差异表达,基本都是5分以下文章;

  第三部,基本都先是靶基因预测和验证,然后看是否有增殖、凋亡、再生和调控某些信号通路之类,然后进行转基因验证。这一步也是烧钱地方,也是技术含量最高的地方,一系列基本实验:WB/IHC/PCR/IF/转染等全是在这里烧钱和花时间,各种mimic、inhibitor和转基因小鼠。但是这一系列下来,文章水平自然不差。

  最近见得比较厉害也比较省时间的就是下面几种:

  1、circRNA测序or芯片,circRNA毕竟还比较新,靠这个发文章这两年不少;

  2、circRNA测序or芯片加上简单功能验证,加上增殖、凋亡等功能,现在的主要方向;

  3、circRNA测序or芯片加上mRNA差异表达;

  4、circRNA or lncRNA测序or芯片,然后找出其互相作用的miRNA,从miRNA方面进行功能解释和验证;

  5、circRNA测序or芯片加上lncRNA测序or芯片,进行组合测序,筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA,然后进行生物信息学分析,筛选Gene Ontology和KEGG功能和信号通路;or进行靶基因预测和验证;还有对筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA进行可能结合miRNA,从miRNA方面进行功能解释和验证,毕竟miRNA功能验证已经成熟和经典,而且存在sponge这个东西,可以互相作用;

  6、circRNA测序or芯片加上lncRNA测序or芯片再加miRNA测序or芯片再再加mRNA差异表达筛选。

  这样说可能比较含糊,来几个案例:

miRNA功能研究.png

  1、单独ncRNA和功能研究,miRNA的很多了,来一个circRNA的与miRNA一个套路,先芯片,然后筛选差异表达,然后简单功能验证。

  2、circRNA or lncRNA测序or芯片,然后找出其互相作用的miRNA,从miRNA方面进行功能解释和验证。

  3、circRNA测序or芯片加上lncRNA测序or芯片,进行组合测序,筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA,然后进行生物信息学分析,筛选Gene Ontology和KEGG功能和信号通路;

  第一步:筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA

  第二步:简单验证

  第三步:Gene Ontology和KEGG、调控网络构建

  circRNA、lncRNA、miRNA等调控性ncRNA可通过与protein、RNA或DNA分子互作,发挥其多样化的调控功能。如何搞定调控性ncRNA研究方案?

  第一步确定ncRNA研究目标

  一般可通过以下三种方法,确定研究目标:(1)通过查阅文献,寻找线索,嫁接研究对象,照猫画虎;(2)通过生物信息学,分析挖掘GEO、TCGA等数据库相关数据,发现潜在研究目标;(3)通过RNA测序、基因芯片等高通量筛查,获得大量一手原创数据,从中自由选择研究目标。

  第二步快速论证ncRNA调控功能

  一般在细胞水平,通过gain/loss of function干预第一步确定的ncRNA,使用Western Blot等方法检测所关注生物学过程(如自噬、凋亡、增殖、迁移等)的相关marker,论证ncRNA的调控功能。

  第三步揭示ncRNA调控作用的分子机制

  首先,确定ncRNA的亚细胞定位。然后,通过targetscan、catrapid、RNAhybrid、lncbase等生物信息学分析工具,预测与ncRNA互作的RNA、protein或DNA;或者,通过gain/loss of function干预ncRNA,再进行RNA测序、基因芯片或蛋白质质谱,筛查ncRNA调控的靶分子。继而,采用RNA pull down、RIP、ChIP、ChIRP、EMSA、Reporter gene assay等技术,论证ncRNA-protein、ncRNA-RNA或ncRNA-DNA互作关系。

 

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/329.html

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