PCR-SSCP分析技术是一种基于单链DNA构象差别的快速、敏感、有效地检测基因点突变的DNA多态方法。下面Bybiotech给大家讲一讲PCR-SSCP实验原理及操作的一些流程。

　　PCR-SSCP实验原理

　　PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳动速率，相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳，与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

　　为了便于观察分析结果，PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物，电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带，此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤，但其灵敏度不如用同位素标记。

　　单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关，但也受到其他条件的影响。因此，PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件，如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。

　　PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。

　　PCR-SSCP的实验操作

　　在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

　　DNA片段长度(核苷酸数) (%)

　　1Kb～700b 3.5

　　700b～500b 5

　　500b～200b 8

　　200b 12

　　在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

　　1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

　　按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使 模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭，备用。

　　2)电泳

　　取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TbE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染。

　　3)银染法

　　将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色。