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实验外包:关于PCR-SSCP实验原理及操作

发布时间:2021-09-17 02:32:01 阅读:18702次 来源:本站

  PCR-SSCP分析技术是一种基于单链DNA构象差别的快速、敏感、有效地检测基因点突变的DNA多态方法。下面Bybiotech给大家讲一讲PCR-SSCP实验原理及操作的一些流程。

  PCR-SSCP实验原理

  PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA,单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象,其构象直接影响泳动速率,相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别,就可以产生立体构象的不同,造成泳动速率的不同,产生不同的泳动带。PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳,与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

  为了便于观察分析结果,PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物,电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带,此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤,但其灵敏度不如用同位素标记。

  单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关,但也受到其他条件的影响。因此,PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件,如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。

  PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性,一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。

  PCR-SSCP的实验操作

  在小于1Kb长度的情况下,DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:

  DNA片段长度(核苷酸数) (%)

  1Kb~700b 3.5

  700b~500b 5

  500b~200b 8

  200b 12

  在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).

  1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)

  按上表制所需的胶液,将梳子插入模子,从梳子一端加入胶,当胶液快到梳齿时,使 模子向加胶端倾斜,继续慢慢加胶,边加边放端模子以防止气泡形成,室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子,顶部加入1×TbE封闭,备用。

  2)电泳

  取10μlPCR产物,加入10μl变性剂(95%甲酰胺,10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油,煮沸5min,取出立刻放入冰浴中2min以上,然后将水相全部上样,10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min,然后在120V电泳8h,取下凝胶,将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TbE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染。

  3)银染法

  将PAG板用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次,再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次,然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后,用0.75%NaCO3终止显色。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/330.html

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