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ELISA实验中常遇到的问题、产生的原因与解决办法

发布时间:2022-12-06 10:38:48 阅读:11212次 来源:百度学术

  酶联免疫吸附实验,简称为 ELISA。ELISA 实验是一种非常经典的免疫学实验。虽然历史非常悠久了,但是还是不断地在临床和基础研究中得到应用。其主要用于:免疫酶染色各种细胞内成份的定位;研究抗酶抗体的合成;显现微量的免疫沉淀反应;定量检测体液中抗原或者抗体成份。小编总结了一些经验教训。遇到的问题,可能的原因,解决方法。供大家参考。

  问题 1:阳性与阴性不能达到 2.1 的比值,阴性颜色太深。

  可能的原因:阴性对照(也就是阳性对照的除目标抗原外的其它成分)中有某种成分与一抗作用。

  解决的方法:纯化抗原除去干扰成分。

  问题 2:阳性与阴性不能达到 2.1 的比值,阳性颜色太浅。

  可能的原因有 3 个: 1)一抗效价不好。 2)抗原太稀。 3)封闭时间过长。

  解决的方法: 1)换用一抗或增加一抗用量。 2)增加抗原浓度。 3)缩短封闭时间,封闭时间一般 37 摄氏度 3 个小时,或者 4 摄氏度过夜。不能比这个更长了。

  问题 3:增加抗原浓度,一抗浓度不变,显色反应没有表现出应有的梯度。

  可能的问题: 一抗与抗原的比例已经饱和。

  解决的方法: 增加一抗用量; 或在一抗用量不变的情况下减少抗原浓度做梯度。

  问题 4:增加一抗浓度,显色反应没有表现出应有的梯度。

  可能的原因:一抗与抗原的比例已经饱和。

  解决的方法:增加抗原用量;或在抗原用量不变的情况下减少一抗浓度做梯度。

  问题 5:加完 TMB 显色后颜色梯度很明显,但加了硫酸终止反应后颜色梯度没有那么明显了。

  可能的原因:硫酸可能把其它成分都炭化了。

  解决的办法:加少一点硫酸,参考值:50 μlTMB+35 μl 硫酸;或者采用 1M 的 HCL 作为终止液,50ulTMB+50ul1M HCL。

  这些步骤里面,一抗和封闭是两个关键。如果 ELISA 做不出满意的结果,首先应该从这两个方面改进。Elisa 实验看似简单,其实不然。别小瞧了ELISA。光是一个加样就有很多讲究。

  ELISA 中加样须注意如下问题:

  吸取样品时,加样枪吸头不应黏附多余的液体;加样时不可 90 度向孔中滴加液体,这样会导致液体残留在吸头上,加样不准确! 不要将吸头伸入孔中,一方面若接触孔底可能压弯吸头,另一方面可能会将孔中的液体吹起来,加样不准确! 正确的加样方法应为 45 度,吸头贴着孔壁加入,应注意: 角度太小,会使液体残留在孔壁上,导致加样不准确! 吸头应当贴着管壁和液面的交界处!

图例

综上所述,Elisa 实验看似简单,其实还是有很多细节需要我们注意的。以上介绍了 Elisa 实验的一些经验教训,希望对大家有所帮助。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hydt/1851.html

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