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常见的三种蛋白定量法(蛋白定量的方法)

发布时间:2022-03-28 10:33:05 阅读:113812次 来源:ProteintechGroup

  蛋白质作为生命活动的物质基础之一,也是生命活动的主要承担者,是科研工作中的重要研究对象。而在这些精细化研究工作中,测定蛋白浓度,定量实验,是探索蛋白生物学功能不可或缺的一个环节。依托不同的科学原理,目前已经发展出多种不同的蛋白测定方法,其中BCA法、Bradford法和UV法在科研实验中应用最为广泛,不过三种方法之间各有千秋,小P今天就和大家一起盘点盘点~

  01

  BCA法

  理:BCA (Bicinchoninic acid,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠),与含二价铜离子的硫酸铜组成BCA检测试剂(商业试剂盒中,碱性的BCA混合溶液与硫酸铜溶液分别包装,标记为A液和B液,二者在实验前比例混合,溶液呈绿色),在碱性条件下,二价铜离子可被蛋白质还原成一价铜离子,一价铜离子能够与BCA相互作用,两分子BCA鳌合一个铜离子,形成稳定的紫色复合物,在562nm处显示强吸光性在一定浓度范围内,复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系,通过酶标仪或者分光光度计以标准品蛋白做标准曲线,随后检测靶标蛋白562nm波长处的吸光值,即可换算出靶标蛋白浓度。

  BCA法作为已知最灵敏的检测方法之一,灵敏度高,普通BCA试剂盒检测范围为20-2000μg/ml,增强型BCA试剂盒最低检测浓度可到0.5μg/ml,检测范围广且线性稳定;同时该方法操作较为便捷,正常情况下可在45分钟内完成测定;不过由于反应中涉及“氧化”和“螯合”两个过程,BCA法检测结果会受到还原剂(如DTT,巯基乙醇等)、金属离子螯合剂(如EDTA等)干扰,不易受表面活性剂(Triton X-100、SDS等)影响。

  02

  Bradford法

  原理:Bradford法也称作考马斯亮蓝法(Bradford为发明人),考马斯亮蓝G250(Coomassie brilliant blue G250),是一种甲基取代的三苯基甲烷,每分子包含两个SO3-H基团,呈酸性,该磺酸基团能够通过范德华力与蛋白质的碱性基团结合形成稳定的染料-蛋白复合物,在595nm波长处有最大吸收峰,游离考马斯亮蓝G250溶液呈现棕红色,与蛋白反应之后变成蓝色;并且在一定浓度范围内,复合物的光密度与蛋白质含量呈线性关系。通过酶标仪或者分光光度计以标准品蛋白做标准曲线,随后检测靶标蛋白595nm波长处的吸光值,即可换算出靶标蛋白浓度。特点:Bradford法作为另一种最灵敏的检测方法,其灵敏度同样可以达到微克级别;并且仅需一种反应试剂即可完成检测,操作十分便捷;同时考马斯亮蓝染料与蛋白样本结合所需时间极短,2分钟即可形成稳定复合物,完成一次检测耗时仅需几分钟。但是,由于蛋白-染料稳定复合物之间是分子间作用力,故Bradford法会受到表面活性剂(Triton X-100、SDS等)干扰,除此之外,不同靶标蛋白中碱性氨基酸(范德华力作用)以及芳香族氨基酸(疏水作用)含量不一,对考马斯亮蓝的结合能力差异较大;而且随着蛋白浓度增加,线性关系会出现偏差。因此Bradford法与BCA法一样,也是一种不完美的检测手段。

  [延伸]:检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质,前者采用考马斯亮蓝G250,后者采用考马斯亮蓝R250,G250和R250分子基本骨架一样,但是G250多了两个甲基,与蛋白反应迅速,染胶慢且脱色困难,故用于蛋白定量;R250与蛋白反应较缓慢,染胶较快且易于洗脱,故用于PAGE胶染色。

  03

  UV法(NanoDrop)

  原理:UV法即紫外分光光度法,蛋白质分子中的芳香族氨基酸,包括色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸,含有可以吸收紫外光的共轭双键,最大吸收峰在280nm波长处,且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成线性关系。通过分光光度计检测靶标蛋白280nm波长,即可根据Beer-Lambert定律(A=E*C*l;A代表吸光度,E代表消光系数,C代表蛋白质浓度,l代表光径长度,其中消光系数可以根据蛋白质序列估测)换算出靶标蛋白的浓度。相较于上述两种检测手段,UV法一个最大的优势就是不用额外添加检测试剂,因此待测样本是可以回收利用的,不影响活性;这也使得UV法具有无与伦比的便捷性和高效性,通过Nanodrop等仪器,我们甚至可以在几秒内直接读出一个蛋白样本的浓度;UV法检测的灵敏度同样可以达到微克级别。UV法优势明显,缺点也极为突出。由于不同蛋白有不同的酪氨酸和色氨酸含量,对紫外光的吸收能力不同,故要准确测量,必须要有待测蛋白质或其它蛋白的纯品作标准品参考;其次,很多化合物在280nm处有吸光值,对实验结果造成干扰,其中核酸影响尤为严重,核酸最大吸收峰在260nm处,故溶液中可能存在核酸时,必须同时测定OD260和OD280,然后根据两种波长的吸收度的比值,通过经验公式校正,以消除核酸的影响 。(一般常用Lowry-Kalcker公式:C(Protein)(mg/ml) = 1.45 * A280 - 0.74 * A260,或者Warburg-Christian公式:C(Protein)(mg/ml) =  1.55 * A280 - 0.76 * A260,来估算蛋白浓度。)

  参考文献:

  1. 周跃男,王湛等.浅谈蛋白质含量的定量检测方法[J].食品研究与开发,2014.

  2. 范双双,李正平.几种检测蛋白质浓度方法的比较[N].承德民族师专学报,2004

  3. 范华杰,李闻捷.蛋白质定量方法的合理应用[J].中华国际医学杂志,2003.


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