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小鼠死亡后尸检操作步骤

2023-07-04 10:25:00
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  摘要

  小鼠尸检的主要目的是通过肉眼观察确定基因工程小鼠或患病小鼠的解剖特征,并描述导致发病率和死亡率的病变。为后续检查采集的组织需要适当处理和保存,以防止变质。

  因此,高效的常规操作对于促进组织学和确保高质量的样本至关重要。此外,优化技术最大限度地减少了损坏样本的数据丢失,减少了使用的动物数量,并支持3Rs“reduction”原则。

  前言

  小鼠尸检是一种以系统方式进行的死后科学检查,能够观察大体解剖并采集组织,作为实验终止研究或动物健康筛查的一部分。小鼠尸检在技术上具有挑战性,各组操作人员之间的技术差异可能影响数据的可比性。

  因此,制定一个标准化的方案和密切监测人员培训非常重要,以保持操作一致性和采集的组织质量。简单的术语表有助于确保操作者之间的描述的一致性。

  本文中的方法平均需要2个小时左右就可以掌握,如果熟练操作,10分钟左右就能够完成1只小鼠的解剖操作。在操作组织或化学试剂时,需要佩戴适宜的PPEs(防护眼镜、手套、白大褂和口罩等)。

  注意:在解剖实验动物前,必须进行培训以掌握解剖技巧。

  解剖前准备

  本文所描述的解剖操作是在两只16周龄的B6J小鼠(雌雄各1只)上进行的。其饲养条件为:IVC饲养,自由采食饲料和饮水,符合动物福利。

  如果需要生化检测以补充大体观察,在解剖前可进行终末采血(全身麻醉后进行)。一旦采集了所有必要的样本,必须对小鼠进行放血或使用其他安乐死方法。采血操作人员必须经过培训。

  采集后的组织置于10%中性缓冲福尔马林溶液中(10% neutral buffered formalin下文简称:10% NBF),除非有其他要求。一些组织可以放置在无纤维吸墨纸上,以避免折叠,并便于在包埋和显微分析时定位。

  提示:10% NBF需要预先准备好,对大多数组织具有良好的固定效果,理想的固定液与组织的比例至少为20:1。固定液体积不足会导致固定效果不良。

  小鼠解剖具体步骤

  对小鼠实施安乐死。在确认小鼠死亡后(即血液循环停止),在解剖前应用70%的酒精浸湿毛皮,以降低过敏原风险。

  穿过腹侧皮肤和腹肌,穿过胸腔的尾缘,在剑骨下方(图1-A和1-B),做一个腹部切口。

  然后从两侧向耻骨方向切开腹部,然后穿过尾腹,切除整个腹侧皮肤。切下的腹部皮肤部分平铺在一张纸上(图1-C)。

  提示:确保切除的腹部皮肤部分足够宽,并包含乳腺组织。

  使用26G 3/8针头和5ml注射器吸取10% NBF对肠道和胃部组织进行灌注(图1-D),以减少自溶,因为小鼠死亡后肠内迅速发生自溶。

  注意:灌注要适量,否则肠道过度膨胀可能导致破裂或过度拉伸。

  然后摘下胃肠道。轻轻按住胃,剪断食道,剥离肠道。剪断骨盆附近的结肠,尽可能完整的取下整个胃肠道。

  提示:抬高小鼠躯体可以使胃肠道远离腹腔,减少剪断结肠时损伤其他组织的风险。

图例

  (am:腹肌;d:膈肌;di:二腹肌;i:肠道;l:肝脏;m:咬肌;o:食管;q:股四头肌;s:皮肤;sc:脊髓;sg:唾液腺;sn:坐骨神经;t:舌头)

  小心剪开肋弓到下颌骨的皮肤,以减少对唾液腺和气管造成损伤(图1-E)。下颌骨唾液腺附着在皮肤上(图1-F)。

  接下来,从靠近前肢的两侧切开胸骨和肋骨,并穿过两侧锁骨(图1-G)。

  提示:剪刀的一个刀片应该插入胸骨上切口,另一个刀片插入肋骨和锁骨外侧,避免损伤胸腺或心脏。注意:避免损伤胸骨,因为胸骨可用于评估骨髓。

  使用26G3/8针头通过气管缓慢向肺部灌注NBF(图1-H)。

  注意:避免多次穿孔气管,因为这会损伤组织。提示:为了有效进行肺部灌注,可以将针头弯曲成90度或保定小鼠头部,以形成合适的针头插入角度。

  依次取下舌头、下颌骨、甲状腺、气管、食道、心脏、胸腺和肺。切断二腹肌和咬肌之间的下颌骨,并轻轻摘取组织器官(图1-I和1-J)。

  一并取下肝脏和膈肌(图1-K),操作肝脏时要轻柔,因为肝脏易碎。

  通过提拉输尿管并切断背侧连接,取下双肾及其相伴的肾上腺(图1-L)。

  如果是雄性动物,取下两个睾丸并放入Hartmann’s固定液中。解剖两个附睾并平放在纸上。将精囊、前列腺和膀胱整体切除,平放于纸上(图2-A至2-D)。

  提示:对于眼睛和睾丸等组织,使用Hartmann’s固定液(改良戴维森)(Cat. H0290-500ML; Merck Life Science)可减少组织收缩和确保足够的固定。

  样品应在室温下固定24-72小时,然后转移到10% NBF中。

  如果是雌性动物,应切开耻骨,从卵巢到阴道口处,整个切除雌性生殖道,(图2-E至2-H)。一并取下膀胱,但不包括结肠,然后放置在纸上。

图例

  (b:膀胱;c:结肠;e:附睾;o:卵巢;sv:精囊;t:睾丸;u:子宫角。)

  剥去颅骨处的皮肤,并在眶间切开颅骨(图1-M),以允许固定剂能够渗透进大脑。双眼应连同视神经一起切除并放入Hartmann’s固定液中。

  剥离从肩部到尾根部的皮肤,去除皮下组织,铺平放在纸上(图1-N)。

  从一侧后肢沿股骨切取股四头肌(图1-O)。通过分割股二头肌暴露坐骨神经,取出并放在纸上(图1-P)。

  注意:尽量减少对坐骨神经的操作,因为它很容易损伤。

  髋关节处取下剩余的后肢和后爪。这个样本包含膝关节,可以脱钙进行组织学检查。

  从寰枕间隙开始,切除两侧椎弓,并切除和收缩背突,使脊髓暴露至腰椎区域(图1-Q和1-R)。胴体放置在10%的NBF中(图1-S),并固定至少24小时。

  提示:脊髓暴露是操作中最具技术挑战性的部分。我们建议使用弯曲的和/或直的弹簧剪刀和胴体定位(平放在解剖台上或弯曲在手上),以减少对组织的张力。

  总结

  这种快速完整的小鼠尸检方法可以保存小鼠的所有组织,并最大限度地从单个标本中获得数据。虽然必须考虑到物种之间的差异,但这种方法很容易在大鼠、仓鼠、兔子等物种上复制。

  不同的固定剂也可以用于满足特定的研究需要。组织可以保存在福尔马林中,或者在最短的固定时间后,可以修剪、加工、石蜡包埋、切片并染色进行组织学分析。

  注意,任何骨样本在包埋前都必须脱钙,以使其更容易切割和避免破碎。

  参考资料:

  1.A guide to post-mortem examination procedure in mouse models,Alexandra Rodrigues1, Lynn Beresford1, Cheryl L Scudamore etc,Laboratory Animals 2022, Vol. 56(5) 466–470

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