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CHIP实验操作详细步骤,免疫共沉淀实验详解

2023-07-02 10:27:37
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  CHIP实验是一种广泛应用于基因调控、转录因子结合和染色质修饰等领域的实验技术。通过该技术,可以鉴定和定量特定蛋白质与染色质上的结合位点,进一步了解基因表达调控的机制。以下是CHIP实验的详细步骤:

CHIP实验操作详细步骤,免疫共沉淀实验详解

  第一步、细胞的甲醛交联与超声破碎。

  (1)取出细胞,加入甲醛,使得甲醛的终浓度为1%。

  (2)37摄氏度孵育10min。

  (3)终止交联。

  (4)吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

  (5)细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中。预冷后离心收集细胞。

  (6)倒去上清。

  (7)超声破碎。

  第二步、除杂及抗体哺育

  (1)超声破碎结束后,离心去除不溶物质。

  (2)在100μl的超声破碎产物中,加入900μl ChIP Dilution Bufer 和20μl × PIC。再各加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4°C颠转混匀1h。

  (3)1h后,在4摄氏度静置10min沉淀,700rpm离心1min。

  (4)取上清。各留取20μl做为input。一管中加入1μl抗体,另一管中则不加抗体。4°C颠转过夜。

  第三步、检验超声破碎的效果

  (1)取100μl超声破碎后产物,加入4μl 5M NaCl,65°C处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。

  (2)电泳检测超声效果。

  第四步、免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)

  (1)孵育过夜后,每管中加入60μl ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4°C颠转2h。

  (2)4°C静置10min后,离心除去上清。

  (3)清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4°C颠转10min,4°C静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。

  (4)清洗完毕后,开始洗脱。

  (5)解交联:每管中加入20μl 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)。混匀,65°C解交联过夜。

  第五步、DNA样品的回收(第三天)

  (1)解交联结束后,每管加入1μl RNAaseA(MBI) ,37°C孵育1h。

  (2)每管加入10μl 0.5M EDTA,20μl 1M Tris.HCl(pH6.5),2μl 10mg/ml蛋白酶K。45°C处理2h。

  (3)DNA片段的回收-omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100μl ddH2O。

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