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细胞划痕实验怎么划痕,细胞划痕实验步骤讲解

2023-05-24 10:33:43
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  细胞划痕实验是指将细胞培养在培养皿或平板上,待细胞融合后用枪头或其他硬物在中央区域画一条线,这条线内的细胞被机械力去除掉了,然后将细胞继续培养,观察细胞向无细胞的划痕区域迁移的情况,来判断细胞的迁移能力。其意义在于:价格低廉,操作简单,还有很重要的一点在于细胞外,围环境简单、单纯,容易控制,是肿瘤细胞基本的研究方法。

细胞划痕实验怎么划痕,细胞划痕实验步骤讲解

  一、实验准备

  实验开始,将离心管、吸管筒、移液枪、枪头,直尺等放入无菌超净工作台,以紫外线照射30min。然后,采用通风机通风3min。取出无菌6孔板,用黑色记号笔在6孔板底部,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔,每孔至少穿过3条线。每条黑线的上下缘与划痕交叉点作为观察点,这样一方面便于观察另一方面可以一次取多个观察点,终可以获得多个数据。画好横线后,在板上分别做好标记。取下试剂瓶和离心管上的封口膜,且将每个试剂瓶和离心管拧松,方便后续试验的操作。

  二、细胞准备

  取出处于对数生长,期的健康细胞,吸掉原来的培养液,用无菌PBS清洗细胞。加入1ml胰酶消化液消化细胞,显微镜下观察所有细胞完,全皱缩变圆后加入完,全培养基终止消化。收集细胞悬液于15ml离心管中,800rpm/min室温离心5min。用罗氏CASY快速细胞计数及活率分析仪进行细胞计数,弃去上清,加入培养基重悬细胞。,以每孔1~4×105细胞的密度接种到6孔培养板上,在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养一天。具体数量因细胞种类不同而不同,掌握为过夜能铺满。

  三、直线划痕

  取出铺满六孔板的细胞,用200ul枪头垂直于细胞表面,由孔一端划向另一端。尽量垂直于背面的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜。此时可在培养皿的表面清晰看到细胞表面呈#字形划痕。

  四、PBS清洗细胞及培养

  吸掉旧培养基,用无菌PBS洗细胞表面3次,去除划下的细胞,加入含有1%胎牛血清的培养基为阴性对照,及含有相应浓度药物的1%胎牛血清培养基为药物刺激组;每组2个复孔。轻轻摇动六孔板,使药物与细胞培养液充分混合,放入37度,5%C02培养箱中培养。

  五、结果观察

  分别取划痕0小时、24hr、48hr后观察不同处理组的痕道宽度。结果可见:细胞划痕后48h观察到对照组细胞划痕宽度恢复约90%,而药物抑制组恢复约60%。表明加入药物后,由于药物的作用,使细胞迁移受到抑制,而未加入药物的细胞保持原有的迁移能力,在48h后通过迁移将划痕掩盖。

  六、注意事项

  1、细胞密度注意细胞生长状况,选择适当的细胞接种密度,对不同的细胞要观察其贴壁率等,保,证培养终止时密度适当。

  2、冲洗细胞缓慢轻柔在用PBS缓冲液冲洗时,注意贴壁缓慢加入,以免冲散单层贴壁细胞,影响实验拍照结果。

  3、低浓度或无血清培养划痕PBS冲洗后应该加入无血清培养基或者低浓度血清培养基,以排除细胞本身增殖对实验的影响。

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