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慢病毒包装实验技术方法

2023-04-18 10:31:31
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  1、实验试剂

  DMEM、超牛血清、G418、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、LipofectamineTM 2000

  2、实验仪器

  细胞培养板,37℃细胞培养箱,离心机,Amicon Ultra-15离心过滤器

  3、293FT细胞的培养

  用于包装病毒的293FT细胞必须处于生长旺盛期,细胞状态良好,细胞边缘清晰,传代次数较低。293FT细胞培养:使用含10%超级新生牛血清的DMEM高糖培养基(并添加0.1mM的非必需氨基酸,2mM的L-谷氨酰胺,2mM的丙酮酸钠,500µg/ml的G418和1%的青霉素或链霉素),置于37℃、5% CO2 细胞培养箱中常规培养,保证细胞生长状态良好。

  4、转染质粒

  细胞铺板:用含有10%FBS的无抗生素DMEM将生长旺盛的293FT细胞以一定密度铺到培养板中,使次日密融合度达到60%左右。分别用脂质体作为转染试剂实现包装质粒和核心质粒的共转,PAX 2、pMD和核心穿梭质粒以3:1:4的比例用LipofectamineTM 2000共转293 FT细胞。转染6h后,移去细胞培养液,更换为新鲜的DMEM培养基。转染后24 h和48h分别于倒置荧光显微镜下观察转染效率并拍照,效率应达到85%以上。

  5、收集病毒

  转染48小时后收集含慢病毒的上清液于无菌的离心管中,3000 rpm,4 ℃离心10 min,取离心后的上清分装到新的无菌的离心管中,-80℃冰箱保存。将包装病毒的细胞培养板中加上新鲜的培养基,72h后再次收获慢病毒上清液并离心处理后于-80℃保存。

  6、慢病毒滴度测定

  慢病毒滴度测定:滴度测定前1天接种HeLa细胞,12孔板中细胞密度为2×105个细胞/孔,含10% FBS的DMEM为1ml/孔,第2天将500µl病毒液及含10% FBS的DMEM 500µl加入到1.5ml的离心管中混匀,并将其加入到预先种好的细胞中,37℃、5%CO2培养箱培养,48h后用流式细胞仪检测阳性率。滴度计算公式:滴度(TU/µl)=阳性率(%)×细胞总数×病毒液稀释倍数/病毒液体积(µl)。

  7、慢病毒的纯化

  运用Amicon Ultra-15离心过滤器进行病毒的纯化

  (1)加入15ml病毒上清液到Amicon Ultra-15离心过滤器。

  (2)将Amicon Ultra-15离心过滤器与另一个离心管配平后放入离心机中。

  (3)4500rpm,4 ℃离心30min即可获得纯化的病毒。

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