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动物细胞DNA提取实验操作流程及注意事项

2023-04-09 10:41:06
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  实验原理:

  DNA提取的原理为裂解细胞,使细胞中的核酸和大分子物质释放出来,然后用一系列的试剂纯化,最后得到DNA的过程。

  实验试剂:

  细胞系A549、组织/细胞DNA提取试剂盒(诺唯赞)、无水乙醇等。

  实验步骤:

  1.实验前细胞准备

  根据说明书要求制备3x1066个细胞,1000g离心后,弃上清,加入200uL PBS溶液、10 μLRNase SoLution和20 μL Proteinase K至样品中,用枪吸打,重悬细胞。

  2.细胞裂解

  加入250μL Buffer GB至细胞重悬液中,涡旋混匀。65摄氏度水浴30分钟,每隔十分钟取出来翻转EP管。

  3.过柱纯化

  加入180 μL无水乙醇至消化液中,涡旋混匀。将gDNA CoLumns吸附柱置于2 mL收集管中。将上一步所得混合液转移至吸附柱中,12,000 转离心1 min。

  注:若出现堵柱现象,再最高转速离心 3-5 min;若混合液超过 750 μL需分次过柱。

  弃滤液,将吸附柱置于收集管中。加入500 μL Washing Buffer A至吸附柱中。12,000转离心1分钟。

  弃滤液,将吸附柱置于收集管中。加入650 μL Washing Buffer B至吸附柱中。12,000 转离心1分钟。(重复一次)。

  弃滤液,将吸附柱置于收集管中。12,000转空管离心2分钟。

  将吸附柱置于新的1.5 mL离心管。加入30 - 100 μL预热至70oC的ELution Buffer至吸附柱的膜中,静置1分钟,12,000 转离心2分钟。

  弃收集柱,得到DNA溶液。

  4.检测

  取1μL溶液进行琼脂糖凝胶电泳,在成像系统中成像,检测DNA提取的质量,结果如图,在marker以上有条明显的条件,即为提取的细胞DNA。

  注意事项:

  1.DNA提取时,EP管和枪头等耗材要先进行高压蒸汽灭菌,去除DNA酶(无酶无菌耗材除外)。

  2.实验前,需保证细胞状态活性良好。若细胞死亡,提取的DNA不完整。

  3.由于实验过程存在有机试剂,实验操作人员严格穿戴实验服和手套。保障自身安全。

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