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细胞凋亡检测试剂盒怎么使用,有什么注意事项

发布时间:2023-03-06 10:40:43 阅读:1592次 来源:百度学术

  细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡是为维持环境稳定,为更好的适应胜春环境而主动争取的一种死亡过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用,是一种字体损伤的现象。常用的目前就是细胞凋亡检测试剂盒。

  细胞凋亡检测试剂盒原理:

  细胞凋亡是细胞的基本特征之一,在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一种分子量为35.8 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)高亲和力特异结合。FITC-Annexin V结合到凋亡细胞后,在蓝色光的激发下,发出绿色荧光,区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)是一种核酸染料,它不能穿透完整细胞膜,但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透,并使细胞核红染。将FITC-Annexin V与PI匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。

  细胞凋亡检测试剂盒使用步骤:

  1. 调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml。 2. 取1ml细胞,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清。 3. 加入1ml预冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清(对于贴壁细胞,先用胰酶消化,再用PBS洗涤)。 4. 重复步骤3两次。 5. 将细胞重悬于200μl Binding Buffer。 6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI,轻轻混匀,避光室温反应15分钟 或4℃反应30 分钟。 7. 加入300μl Binding Buffer,在1小时内用流式细胞仪检测。 8. 若用荧光显微镜检测,将细胞混合液离心,取细胞沉淀涂片,再进行观察。

  使用细胞凋亡检测试剂盒的注意事项:

  1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

  2.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质,在保存与操作时请注意避光。

  3.Propidium iodide(PI)能通过皮肤吸收,对眼睛有刺激作用。

  4.在细胞洗涤的zui后一步,请尽量将上清弃净,以免PBS残留影响实验结果。

  5.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行Annexin V-FITC染色,上机前5分钟再加入PI染色。

  6.整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作。

  7.反应完毕后请尽快检测,因为细胞凋亡是一个动态的过程,反应1小时后荧光强度就开始衰变。

  8.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响,如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等,把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/2090.html

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